1、第5 7卷第2期华中师范大学学报(自然科学版)V o l.5 7 N o.22 0 2 3年4月J OUR NA LO FC E N T R A LCH I NANO RMA LUN I V E R S I T Y(N a t.S c i.)A p r.2 0 2 3收稿日期:2 0 2 2-0 2-1 2.基金项目:四川省科技厅应用基础重点项目(2 0 1 8 J Y 0 0 8 7);四川省科技厅重点研发项目(2 0 1 8 N Z 0 0 5 5).*通信联系人.E-m a i l:s t a r t h l h 1 2 6.c o m.D O I:1 0.1 9 6 0 3/j.c n
2、 k i.1 0 0 0-1 1 9 0.2 0 2 3.0 2.0 1 1文章编号:1 0 0 0-1 1 9 0(2 0 2 3)0 2-0 2 6 2-1 1半乳糖代谢酶u g e1基因的缺失导致裂殖酵母有丝分裂中细胞动力学的变化谭秀梅1,2,丁 祥3,袁荣美4,白 鑫1,蒲帝宏1,叶姿妤1,侯怡铃1*(1.西华师范大学生命科学学院,西南野生动植物资源保护教育部重点实验室,四川 南充6 3 7 0 0 9;2.四川宜宾南溪经济开发区管理委员会,四川 宜宾6 4 4 1 0 0;3.西华师范大学环境科学与工程学院,四川 南充6 3 7 0 0 9;4.四川省疾病预防控制中心,成都6 1 0
3、 0 4 4)摘 要:u g e1基因编码一种参与半乳糖代谢的酶,对细胞生长和有性繁殖等有着重要作用.该文以裂殖酵母(S c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b e)为材料,采用激光共聚焦活细胞成像的方式首次探究了u g e1基因缺失对有丝分裂的分裂期染色体、纺锤体、肌动蛋白动力学的影响.对间期微管的观察结果显示,u g e1 细胞中含有5根微管的细胞比例增加.有丝分裂期的染色体、纺锤体动力学结果表明,u g e1基因缺失会导致染色体分离异常、单极纺锤体的出现、纺锤体从形成到解聚的时间显著增加.u g e1基因缺失还会影响裂殖酵母有丝分裂前期和后
4、期纺锤体伸长.纺锤体形成类型显示,u g e1 细胞中“棒状”纺锤体的比例显著降低,而“点状”纺锤体比例则显著增加.u g e1 细胞的形态相较野生型细胞有显著变化,表现为长度增加及长宽比增加.肌动蛋白动力学跟踪结果表明,u g e1 细胞中肌动蛋白束长度、从聚合到解聚的时间、停留时间和收缩时间均显著增加,而肌动蛋白从聚合到解聚的速率显著降低.以上结果表明,u g e1基因缺失会导致有丝分裂染色体、纺锤体及肌动蛋白动力学缺陷.关键词:裂殖酵母;u g e1;基因缺失;有丝分裂;细胞动力学中图分类号:Q 2 9 1文献标志码:A开放科学(资源服务)标志码(O S I D):u g e1基因编码尿
5、苷二磷酸葡萄糖4-表异构酶1(UD P-g l u c o s e4-e p i m e r a s e,UG E 1),由3 5 5个氨基酸组成,相对分子量为3 9.2 3 k,它主要参与半乳糖代谢、蛋白质半乳糖基化和UD P-半乳糖生物合成.裂殖酵母u g e1基因缺失菌株表现出严重的半乳糖基化缺陷及细胞的UD P-半乳糖水平降低1.多糖胶囊是新型隐球菌的主要毒力因子,它主要由两种多糖组成:葡糖醛酸甘露聚糖和半乳糖氧基甘露聚糖2-3,研究表明半乳糖代谢在新型梭状芽孢杆菌的毒性中起核心作用4.新生隐球菌u g e1基因缺失会影响半乳糖氧基甘露聚糖的产生,并合成较大的胶囊,进而影响新型隐球菌毒
6、力,在细胞免疫功能低下的患者(主要是艾滋病患者)中引起致命性脑膜炎5.裂殖酵母u g e1菌株在含有甘油作为主 要 碳 源 的 培 养 基 中 表 现 出 生 长 缺 陷6.u g e1基因缺失会降低裂殖酵母交配率7-8,并导致有性繁殖过程中出现形态异常的细胞8,且缺失突变体对4-硝基喹啉-N-氧化物、5-氟尿嘧啶、喜树碱、铬、克霉唑、钴等药物敏感9-1 6.u g e1基因缺失亦会导致裂殖酵母生长缓慢1 7,从而影响细胞周期,并增加MC B启动子的转录1 8.细胞分裂是所有生物体的基本特征.裂殖酵母通过有丝分裂产生子代细胞更新及扩增与母细胞具有相同倍性的细胞.在裂殖酵母有丝分裂过程中,正常的
7、染色体分离对于细胞分裂的成功至关重要1 9.有研究报道,纺锤体动力学的不规则性可以导致小鼠染色体分离错误,导致癌症、先天性疾病和细胞死亡2 0-2 1.肌动蛋白是在真核生物中发现的最丰富和高度保守的蛋白质之一,对大多数真核细胞(植物细胞除外)的生存至关重要2 2.有丝分裂期染色体、纺锤体及肌动蛋白动力学是细胞有丝分裂过程中重要的表征.研究裂殖酵母有丝分裂动力学有助于理解细胞分裂的机制及相关疾病2 3.目前,u g e1基因缺失对有丝分裂分裂期染色体、纺 第2期谭秀梅等:半乳糖代谢酶u g e1基因的缺失导致裂殖酵母有丝分裂中细胞动力学的变化2 6 3 锤体及肌动蛋白动力学影响的研究尚未见报道.
8、本课题采用激光共聚焦活细胞成像的方式来探究u g e1基因缺失对裂殖酵母细胞有丝分裂染色体、纺锤体、肌动蛋白动力学的影响,拟为研究细胞分裂机制及疾病提供理论依据.1材料与方法1.1主要材料与仪器1.1.1主要实验材料 野生型裂殖酵母及供试基因缺失型裂殖酵母菌株采用3 0%甘油保存于西南野生动植物资源保护教育部重点实验室-8 0冰箱,本实验所用主要菌株见表1.表1 主要菌株清单T a b.1 L i s to fm a i ns t r a i n s菌株编号基因型P T.2 8 6h-w tP T.2 8 7h+w tP T.4 4 3 6h-h h t1-r f p:k a n Rg f p
9、-a t b2:k a n RP T.3 8 5 0h+P a c t1-L i f e A c t-m g f p:L E U1HY.1 6 8 6h+u g e1:k a n RHY.1 6 8 6-1h+u g e1:k a n Rh h t1-r f p:k a n Rg f p-a t b2:k a n RHY.1 6 8 6-2h+u g e1:k a n RP a c t1-L i f e A c t-m g f p:L E U11.1.2主 要 实 验 试 剂 裂 殖 酵 母 完 全 培 养 液Y E 5 S(T h e r m oF i s h e rS c i e n t
10、i f i c公司)、裂殖酵母产孢培养基EMM-N(T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c公司)、蜗牛酶(源叶生物公司)、山梨醇(麦克林公司)、乙二胺四乙酸(E D T A)(麦克林公司)、巯基乙醇(T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c公 司)、甘 油(德 国B I O F R O X X公 司)、遗 传 霉 素(G 4 1 8)(T h e r m oF i s h e rS c i e n t i f i c公司)等.1.1.3主要实验仪器 M S C-A d v a n t a g eTM级生物安全
11、柜(T h e r m oS c i e n t i f i c公司)、L D Z X-3 0 F A全自动压力蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)、TH Z-Q恒温摇床(上海百典仪器设备有限公司)、B X 5 1奥林巴斯显微镜(日本奥林巴斯公司)、T C S-S P 8激光共聚焦(德国徕卡公司)、DM I 3 0 0 0 B倒置荧光显微镜(德国徕卡公司).1.2实验方法1.2.1裂殖酵母菌株荧光标记的构建 将要构建的基因缺失菌株(h+)和带有荧光标记的野生型菌株(h-)涂布 在Y E 5 S固 体 培 养 基 上 活 化,置 于2 5恒温培养3d.刮取等量的活化好的h+和h-菌体,在EMM-N固
12、体培养基上充分混匀后涂布,置于2 5条件下培养.从EMM-N固体培养基中刮取适 量的h+和h-产孢后的 混合菌体,放 入1 0 0L的蜗牛酶悬浮液(1 0gm L-1)中,室温静置过夜.待子囊及细胞壁完全水解后用蒸馏水洗涤3次,离心收集E P管中裂解产物.将裂解产物用无菌蒸馏水稀释1 0 0倍后,取1 0L裂解产物用无菌涂布器将其均匀的涂布到在G 4 1 8固体培养基上,2 5条件下恒温培养,挑选出单克隆,扩大培养,并通过倒置荧光显微镜镜检找到带有红色荧光蛋白标记的核小体组蛋白(H h t 1-R F P)和 绿色荧光蛋白标记的-微管蛋白(A t b 2-G F P)标记的菌株及带有 绿 色
13、荧 光 蛋 白 标 记 的 肌 动 蛋 白(p A C T 1-L i f e A c t-mG F P)标记的菌株.将构建成功的菌株进行纯化并甘油保存于-8 0冰箱.1.2.2活细胞成像 该研究中的活细胞成像由L e i c aT C S-S P 8激光共聚焦显微镜收集,每9 0s获取包含7个平面的光学切片,曝光时间为4 0 0m s,像素为5 1 2p t 5 1 2p t,线平均数为3,激光强度为3%.对于最大扫描图像,7个平面总共6.0 2m的堆叠图像.所有成像实验均在室温2 5下进行.1.3统计学分析I m a g eJ图像处理软件对所有活细胞成像进行处理,并且对分裂间期微管长度、分
14、裂期的纺锤体长度及不同时期的细胞长度、宽度进行测量.使用I m a g eJ图像处理软件控制相同的VAN I L E比值,避免荧光强度给统计带来误差.使 用K a l e i d a g r a p h 4.0(h t t p:/www.s y n e r g y.c o m)对数据进行分析并作图,在箱图中,最上方、最下方的线分别表示数据的最大值和最小值,箱图中中间的表示平均数,箱图中中间的线段表示中位数.采用S P S S 2 3.0软件对实验数据(m e a n S D)进行单因素方差分析检验.p0.0 5代表差异显著,p0.0 1代表差异极显著.2结果2.1u g e1基因缺失对裂殖酵母
15、间期微管的影响用A t b 2-G F P作为间期微管的检测信号,分析u g e1基因缺失对裂殖酵母有丝分裂间期微管的影响(图1 a和1 b).单个细胞中微管束数目统计结果显示,野生型细胞拥有3、4和5根微管的比例分别为(1 1.6 72.8 9)%、(7 3.3 35.0 0)%和(1 5.0 05.7 7)%,而u g e1 细胞拥有3、4和5根微管的比例分别为(6.6 72.8 9)%、(5 8.3 35.7 7)%和(3 5.0 05.0 0)%,其中u g e1 细胞存在5根微管的数量与野生型细胞相比差异极显著(p0.0 1).进一步对微管长度统计分析如图1 c显示,野生型2 6 4
16、 华中师范大学学报(自然科学版)第5 7卷细胞和u g e1 细胞的在间期微管平均长度分别为6.5 72.2 7m和6.3 02.1 5m,这两组数据无显著差异.以上结果表明u g e1基因缺失会导致裂殖酵母细胞间期微管数量趋于增加,但对微管的平均长度无影响.a c分别为有丝分裂间期微管形态,微管数量统计(n=6 0),微管长度统计图(n=8 0)注:*表示p0.0 5,*表示p0.0 1,圆点表示异常值,下同.图1 u g e1基因缺失对裂殖酵母有丝分裂间期微管的影响F i g.1 E f f e c to fu g e1g e n ed e l e t i o no nm i c r o t u b u l e so fS c h i z o s a c c h a r o m y c e s p o m b ed u r i n g i n t e r p h a s eo fm i t o s i s2.2u g e1基因缺失对有丝分裂期间染色体和纺锤体的动力学影响 染色体正确分离对遗传物质的传递至关重要.用H h t 1-R F P与A t b 2-G F P分别作为有丝分裂