1、第 卷 第 期北华大学学报（自然科学版）年 月 （）文章编号：（）：朝鲜崖柏挥发性化合物及其相关基因表达周立平，胡佰策，牛世丹（中国铁路沈阳局集团公司沈阳林业管理所，辽宁 沈阳；吉林省林木种苗管理站，吉林 长春；吉林省林业勘察设计研究院，吉林 长春）摘要：朝鲜崖柏（）体内含有挥发性化合物，具有药用价值，研究挥发性化合物的相关基因对了解其合成十分重要使用气相色谱质谱（）技术分析朝鲜崖柏体内挥发性化合物，根据转录组数据的代谢途径确定与挥发性物质相关的基因；用定量（）研究挥发性物质相关基因的表达模式共鉴定出 种挥发性化合物结果表明：烯，（，）（）、双环十五碳，二烯醇、，五甲基（，）（）、十六烷（）和
2、，联苯，四甲基（）是朝鲜崖柏的主要化合物，并发现 种化合物具有同分异构体；代谢途径分析表明，与 烯和角鲨烯合成相关的 个基因被注释到两个代谢途径上，这 个基因涉及 二磷酸酯合成酶、合成酶和角鲨烯合成酶；与 月的基因表达量相比，所有的基因在 月、月和 月均上调表达，而在 月、月、月、月、月、月和 月下调表达研究结果揭示了朝鲜崖柏挥发性化合物的生物合成途径，有助于朝鲜崖柏的有效利用关键词：朝鲜崖柏；气相色谱质谱；转录组；定量 中图分类号：文献标志码：收稿日期：基金项目：国家重点研发计划项目（）作者简介：周立平（），男，工程师，主要从事林木遗传育种研究，：；通信作者：牛世丹（），男，高级工程师，主要
3、从事森林规划与调查研究，：，（，；，；，）：（）（）（），（，）（），（，）（），（），（），：；崖柏是崖柏属（）中针叶常绿乔木或灌木的通用名称崖柏属植物主要分布在东亚和北美洲，其中一些树种具有药用价值，如朝鲜崖柏（）、北美香柏（）、北美乔柏（）、日本崖柏（）和崖柏（），富含挥发性油崖柏叶片可用于治疗风湿病，挥发油可用于治疗人类乳头瘤病毒、生殖器疣或普通疣此外，通过蒸馏获得的挥发油可用于生产香水、杀虫剂、肥皂和除臭剂许多崖柏栽培品种具有香气和观赏价值朝鲜崖柏是一种常绿灌木或小乔木，原产于长白山地区和朝鲜半岛；种子成活率低，加之被过度开发，天然种群的地理分布范围大大减少，自然再生能力很弱中国长白
4、山和韩国雪岳山均设立了朝鲜崖柏自然保护区在国家重点保护野生植物名录中，朝鲜崖柏被列为国家二级保护植物，在世界自然保护联盟濒危物种红色名录（）中被列为易危物种曾有研究者分析了朝鲜崖柏的挥发性化学成分，也有研究利用 测序技术获得了朝鲜崖柏不同组织的转录组数据，并发现一些基因参与了挥发性化合物的生物合成但总体上看，有关朝鲜崖柏挥发性相关基因的研究很少针对这一问题，我们利用气相色谱质谱（）技术测定朝鲜崖柏幼苗中的挥发性化合物，通过研究相关基因的时间过程表达，深入理解挥发性化合物的生物合成，为朝鲜崖柏的有效利用提供理论支持 材料和方法 供试材料朝鲜崖柏插穗从吉林省长白县林场（，）采集，扦插成活后将扦插苗
5、移植到长白山特色森林资源保护与高效利用国家林业和草原局重点实验室培育 月采收 株朝鲜崖柏幼苗进行挥发性化合物测定为研究朝鲜崖柏的基因表达，从 月到 月的每个月初采样，每次取 株幼苗，共收集 株取样后立即在液氮中冷冻，并保存在 冰箱中备用 挥发性化合物测定朝鲜崖柏幼苗用 系统进行热脱附一级热脱附温度为 ，脱附 ；二级热脱附温度为 ，脱附 用 系统进行 分析，研究朝鲜崖柏的挥发性化合物色谱柱为 柱（，），载气为氦气（流速为 ）保持 ，然后以 的速度升温至 ，最后以 的速度升温到 ，保持 进样器温度为 质谱电子能量为 ，扫描质核比为 将所得数据与美国国家标准与技术研究院（）的参考数据库进行比对，确定
6、成分，用峰面积归一化方法计算相对含量 挥发性化合物及其相关基因的代谢途径分析根据朝鲜崖柏的转录组数据，将组装的序列和挥发性化合物在 数据库中注释，分析与挥发性化合物相关的基因功能 挥发性化合物相关基因的表达量测定提取总，研究朝鲜崖柏的挥发性化合物相关基因表达选择 个基因（：、：、：、：、：、：、：、：、：、：、：、：、：和：）对参与 烯和角鲨烯生物合成的基因进行 分析引物由 软件设计（见表）使用 试剂盒（，）提取样品，并用（无）分离消化以去除污染的 使用 试剂盒合成第一链 将 稀释 倍，作为 的模板 体系包含 模板、和 引物（），加水补足至 反应在 定量 仪上进行：首先，；其次，进行 个循环，
7、后读板试验设置 次重复，按 计算相对表达量以 和 为内参基因北华大学学报（自然科学版）第 卷表 定量 引物 基因正向引物（）反向引物（）：结果与分析 挥发性化合物的种类与含量利用 分析朝鲜崖柏中的挥发性化合物，共发现 种化合物，包括 种烃类、种酯类、种醇类、种萘类和 种二萜类，占总挥发物的（表）其中，烯，（，）（）、双环十五碳，二烯醇、，五甲基（，（）、十六烷（）、，联苯，四甲基（）为主要挥发物此外，还有 种挥发物具有同分异构体，包括十六烷（种异构体，）、壬烷，二甲基（种异构体，）、（）（）高辛烯基甲基丁烯酸酯（种异构体，）、癸烷，二甲基（种异构体，）、，联苯，四甲基（种异构体，）、，二异丙基
8、萘（种异构体，）、（），（），二烯（种异构体，）、邻苯二甲酸二丁酯（种异构体，）、松柏烯（种异构体，）和 烯（种异构体，）表 朝鲜崖柏的挥发性化合物 （保留）化合物分子式相对含量 双环己烯，甲基（甲基乙基）戊酮，（甲基苯基）苯，（丁氧基甲基）（，）异丙基亚甲基双环己烷基乙酸酯双环庚醇，三甲基，乙酸酯，（内）戊二酸，氟苯基 甲氧基苄基酯双环辛，三烯，二酮二硫化物，双（甲基乙基）醋酸萜品酯丙酸，甲基乙基羟基己酯脯氨酸，烯丙氧基羰基，辛酯磷酸，氯乙烯基二甲酯，四甲基癸炔，二醇邻苯二甲酸，氟硝基苯基甲酯丁基化羟基甲苯，二甲基（甲基乙烯基），（，）第 期周立平，等：朝鲜崖柏挥发性化合物及其相关基因表达表
9、（续）（保留）化合物分子式相对含量 异丙烯基，二甲基，八氢萘癸烷壬烷，二甲基（）（）高辛烯基 甲基丁烯酸酯壬烷，二甲基环己烷甲醇，乙烯基，三甲基（甲基乙烯基），（，）十六烷亚硫酸，乙基己基己酯环戊烷，羟甲基，二甲基己烯雌酚十六烷反式双油灵环氧化物癸烷（，二甲基，六氢萘基）丙醇，二异丙基萘（，二甲基，六氢萘基）丙醇十六烷，联苯，四甲基四唑胺，环庚三烯，甲基（甲基，环庚三烯基），联苯，四甲基苯，（甲基丙烯，二基）双，二异丙基萘己烷，二甲基，二异丙基萘，二异丙基萘庚烷，三甲基癸烷癸烷，乙基甲基丙氨酸，（氟三氟甲基苯甲酰基），辛酯（），（），二烯十六烷（），（），二烯十六烷苯磺酰胺，苯二甲酸，双（甲基
10、丙基）酯己烷，三甲基十六烷邻苯二甲酸二丁酯，三甲基（甲基乙基）（，）菲，乙烯基，十二氢，二甲基亚甲基（，），三甲基（甲基乙基）（，）邻苯二甲酸二丁酯菲，乙烯基，十二氢，四甲基（，）烯亚硫酸，异丁基戊酯异丙基，三甲基，八氢菲烯烯北华大学学报（自然科学版）第 卷表（续）（保留）化合物分子式相对含量（，），三甲基乙烯基，十二氢菲甲醛双环 十五碳，二烯醇，五甲基（，）苯酚，八氢，三甲基（甲基乙基），（反式）铁醇（，），二甲基（丙亚基），十二氢菲基）乙酸甲酯，氧杂磷空穴，双（，二甲基乙基），二氢羟基氧化物缬氨酸，（氟三氟甲基苯甲酰基）十二烷基酯二七烷角鲨烯 注：相同而保留时间不同的化合物为同分异构体 挥
11、发性化合物相关基因参与的代谢途径为了进一步研究朝鲜崖柏的挥发性化合物和转录组数据，将挥发性化合物和基因在 数据库中进行注释在 数据库中，注释了本试验发现的 种挥发性化合物，分别为 崖柏烯（）、乙酸萜品酯（）、丁基化羟基甲苯（）、邻苯二甲酸二异丁酯（）、邻苯二甲酸二丁酯（，种异构体）、松柏烯（，种异构体）、烯（，种异构体）、铁醇（）和角鲨烯（）在转录组数据中，有 个基因注释到 个途径基因注释最多的途径为核糖体（，个基因），其次是碳代谢（，个基因）、氨基酸的生物合成（，个基因）、内质网的蛋白质加工（，个基因）和剪接体（，个基因）仅有 种挥发性化合物（包含 烯 种异构体和角鲨烯）和 个基因同时被注释
12、到两个途径这些基因可以分为两组：第 组基因参与 烯的生物合成，包括参与 二磷酸合成酶（，：）和 合成酶（，：）的 个基因；第 组是参与角鲨烯生物合成的基因，包括参与角鲨烯合成酶（，：）的 个基因（表）表 参与 烯和角鲨烯生物合成的基因 代谢途径酶基因 注释 ：二磷酸合成酶：二磷酸合成酶：二磷酸戊二酯合成酶：二磷酸合成酶烯生物合成：二磷酸合成酶：二磷酸合成酶：二磷酸戊二酯合成酶：二磷酸合成酶：二磷酸合成酶：合成酶：合成酶角鲨烯生物合成：角鲨烯合成酶：角鲨烯合成酶：角鲨烯合成酶第 期周立平，等：朝鲜崖柏挥发性化合物及其相关基因表达 挥发性化合物相关基因表达通过 研究 个参与 烯和角鲨烯生物合成的基
13、因在不同时间的表达模式，结果见图 由图 可知：基因表达在不同时间有明显变化与 月相比，所有的基因在 月、月和 月均上调表达，而在 月、月、月、月、月、月和 月均下调表达这些基因根据其峰值表达模式可以分为 组：第 组是在 月表达量达到峰值的基因，包括：、：和：；第 组是在 月达到表达高峰的基因，包括：、：、：、：、：、：和：；第 组是在 月表达量达到峰值的基因，包括：、：、：和：此外，与 月的表达量相比，：、：、：、：和：等基因在 月上调表达，：、：、：、：、：、：、：、：和：在 月下调表达图 朝鲜崖柏挥发性物质相关基因的时间过程表达 结论与讨论近几十年来，因富含挥发性化合物，朝鲜崖柏被人们所熟
14、知 等通过 分析朝鲜崖柏枝叶精油的化学成分，从 种分离成分中鉴定出 种成分，占精油的，主要成分是乙酸香芹酯（）、葑酮（）、苧酮（）、桧烯（）和 松油醇（）等从朝鲜崖柏叶子精油 种分离成分中鉴定出 种成分，占精油的，主要有 苧酮（）、桧烯（）、乙酸葑酯（）、双环庚醇、，三甲基乙酸酯、（内）（）、环己烯醇 甲基甲基乙基（）、樟脑（）、对孟买基乙酸酯（）杨智蕴等确定了朝鲜崖柏叶子挥发油中的 种化合物，占总精油量的，主要有 郁金香酮（）、乙酸龙葵酯（）、郁北华大学学报（自然科学版）第 卷金香烯（）、榄香脂（）、芬香酮（）、萜品醇（）和沙棘醇（），并从油中分离出芬香酮、萜品醇、乙酸龙葵酯和榄香脂与上述文
15、献相比，本研究在挥发性化合物的数量和质量上都有很大突破，共鉴定出 种挥发性化合物，其中，烯，（，）（）占一半以上此外，本研究首次从朝鲜崖柏中发现了同分异构体不同于以前使用叶片作为试验材料，本研究选择的材料更广，对包括叶片、茎和根在内的苗木整体进行了研究通过代谢途径分析，在 烯生物合成中发现了 个基因，包括参与 二磷酸合成酶和 合成酶的基因之前有学者证明 烯是针叶树中重要的挥发性化合物，牻牛儿基二磷酸途径是 烯的主要生物合成途径烯由 二磷酸生物合成，而 二磷酸由牻牛儿基二磷酸合成酶催化本研究发现，与 月基因表达量相比，月、月和 月有 个基因上调表达，这一结果表明，烯在夏季的含量可能比其他季节高角
16、鲨烯是一种在植物中合成的线性三萜，是合成甾醇、激素或维生素等次级代谢物的前体本研究表明，参与角鲨烯合成酶的 个基因在夏季上调表达角鲨烯由法尼基二磷酸生物合成、角鲨烯合成酶催化：、：、：这 个基因可能与朝鲜崖柏的角鲨烯生物合成有关本研究在朝鲜崖柏中发现了 种挥发性化合物，但只有 种挥发性化合物在 数据库中被注释；烯和角鲨烯以及相关 个基因被注释到两个途径，未来应进一步对朝鲜崖柏的其他挥发性化合物开展研究参考文献：，（），：，：，：，（）：，：，：，：，（），：，：，：，：王戈戎，夏富才，穆怀志，等青楷槭不定根形成的解剖学研究北华大学学报（自然科学版），（）：金慧，赵莹，刘丽杰，等长白山区濒危植物朝鲜崖柏种群数量特征及动态应用生态学报，（）：尹航，金慧，赵莹，等濒危植物朝鲜崖柏克隆种群可塑性及其对土壤条件的响应生态学杂志，（）：，：第 期周立平，等：朝鲜崖柏挥发性化合物及其相关基因表达 ，（）：杨智蕴，田作霖，刘群，等朝鲜崖柏叶挥发油化学成分研究东北师大学报（自然科学版），（）：，：，（）：，：，（）：，（）：，：，（），：，（），：，：，：，：，：，：，：【责任编辑：郭 伟】北华大学学报