1、茶叶通讯第 50 卷第 1 期Journal of Tea Communication Vol.50,No.1投稿平台：http:/基于 Illumina Miseq 高通量测序技术探究藏茶 发酵过程中微生物菌群变化邓俊琳1，何扬航2，陈建1，朱永清1，向卓亚1，张文会3，阎莹莹3，夏陈1*，刘刚2，施刘刚41.四川省农业科学院 农产品加工研究所，四川 成都 610066；2.四川师范大学 生命科学学院，四川 成都 610066；3.西藏自治区农牧科学院 农产品开发与食品研究所，西藏 拉萨 850000；4.雅安市雅州恒泰茶业 有限公司，四川 雅安 625100摘要：应用 Illumina M
2、iseq 高通量测序技术，研究藏茶毛茶（MC）、发酵阶段（S1 S5）及成品茶（S6）中的微生物的多样性与群落结构，并从成品茶（S7）中分离纯化出三株优势曲霉进行鉴定。结果表明，在 S1 S5 阶段，真菌丰度和多样性先降低后增加，而细菌丰度和多样性先增加后减少；多样性分析表明，S1 S5 阶段藏茶中微生物组成趋于相近，而毛茶与成品茶均与 S1 S5 阶段有明显区分。优势真菌为子囊菌门曲霉属，经分离纯化鉴定为冠突曲霉、泡盛曲霉和米曲霉；细菌以变形杆菌、厚壁菌、放线菌和拟杆菌为优势菌，发酵全过程无稳定的优势细菌。关键词：藏茶；渥堆发酵；Illumina MiSeq 技术；微生物多样性；曲霉属中图分
3、类号：S571.1 文献标识码：A 文章编号：1009-525X（2023）01-104-113Analysis of Microbial Flora Changes during Fermentation of Tibetan Tea by Illumina MiSeq High-throughput Sequencing TechnologyDENG Junlin1，HE Yanghang2，CHEN Jian1，ZHU Yongqing1，XIANG Zhuoya1，ZHANG Wenhui3，YAN Yingying3，XIA Chen1*，LIU Gang2，SHI Liugang4
4、1.Institute of Agro-products Processing Science and Technology,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu 610066,China;2.College of Life Science,Sichuan Normal University,Chengdu 610066,China;3.Institute of Agricultural Products Development and Food Science,Tibet Academy of Agricultural and An
5、imal Husbandry Sciences,Lasa 850000,China;4.Yazhou Hengtai Tea Industry Co.LTD,Yaan 625100,ChinaAbstract：IIllumina Miseq high-throughput sequencing technology was used to analyze the microbial diversity and community structure of Tibetan tea of raw tea(MC),fermentation stage(S1 S5)and finished tea(S
6、6),and three dominant Aspergillus strains were isolated and purified from finished tea(S7)for identification.The results showed that in the S1 S5 stage,the abundance and diversity of fungal communities first decreased and then increased,while the abundance and diversity of bacteria communities first
7、 increased and then decreased.diversity analysis showed that the microbial composition of Tibetan tea in the S1 S5 stage tended to be similar,while the crude tea and finished tea were significantly different from those in the S1 S5 stage.At the phylum level,ascomycetes were predominant,and at the ge
8、nus level,收稿日期：2022-10-21 修订日期：2022-10-26基金项目：四川省农业科学院 1+9 科技攻关项目（1+9KJGG007），四川省科技计划资助重点研发项目（2019YFN0178）第一作者：邓俊琳（1988），女，甘肃临夏人，助理研究员，研究方向：功能食品。*通信作者：夏陈（1983），男，四川邻水人，副研究员，研究方向：功能食品。E-mail:154541462 邓俊琳,何扬航,陈建,等.基于 Illumina Miseq 高通量测序技术探究藏茶发酵过程中微生物菌群变化 J.茶叶通讯,2023,50(1):104-113.DENG Junlin,HE Yang
9、hang,CHEN Jian,et al.Analysis of Microbial Flora Changes during Fermentation of Tibetan Tea by Illumina MiSeq High-throughput Sequencing TechnologyJ.Journal of Tea Communication,2023,50(1):104-113.105邓俊琳等：基于 Illumina Miseq 高通量测序技术探究藏茶发酵过程中微生物菌群变化第 1 期藏茶是四川特色黑茶，通过四川省内的甘孜、阿坝等地区销往西藏、青海、甘肃以及其他少数民族地区。由于主
10、销地为边疆少数民族，故也称“边销茶”1。有研究称，最早的黑茶源于四川，当时无黑茶制茶工艺，销往川藏地区的茶叶是经过杀青、干燥的常规绿茶2。藏区交通不便，茶叶运输方式主要通过人背马驮；为多销茶叶，必须压缩，遇刮风下雨，茶叶受潮，又经过风吹日晒干燥，如此重复形成了发酵，而这种茶叶反而更受藏区人民的喜爱3。在此巧合下，蜀人创新了制茶方式，逐渐形成了人们熟悉的藏茶4。藏茶具有丰富的茶多糖、酚类物质、茶氨酸、茶褐素等生物活性成分5，具有降血糖6、降血脂7、抗氧化8等多种功效，在藏区素有“腥肉之食非茶不消，青稞之热非茶不解”9。研究认为，在微生物所分泌的胞外酶的酶促作用、茶叶本身的湿热作用以及微生物呼吸代
11、谢产生的热量的协同作用下，茶叶的内含成分发生一系列复杂的生物化学变化，形成了黑茶特有的品质特征10-11。由于黑茶的品质主要形成于其独特的发酵工艺，因此黑茶渥堆过程中微生物的研究一直是调控黑茶品质的关键。藏茶使用的黑毛茶原料为中叶或者小叶种绿茶，生产工艺是在传统黑茶发酵工艺上大幅改进，这些改进使得藏茶风味、品质与其他黑茶存在较大差异性，但渥堆发酵依然是藏茶生产的核心工序。关于藏茶微生物的研究主要集中于成品茶，对整个发酵过程微生物研究较少，且研究方法过时，结果不准确。本研究通过 Illumina Miseq 高通量测序技术对藏茶发酵过程中的微生物进行探究，为优化藏茶渥堆发酵工艺等提供理论参考。1
12、 材料与方法1.1 材料与仪器1.1.1 试验材料 藏茶由四川省雅安市名山区的雅安市雅州恒泰茶业有限公司提供，特级金花藏茶毛茶材料为 2014 年 302 型。E.Z.N.A.Soil DNA Kit，美国欧米茄生物公司；NEB Q5 DNA 高保真聚合酶，普洛麦格公司。1.1.2 主要仪器2720型PCR扩增仪，美国欧米茄生物公司；FLX800T 型酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；DYY-6C 电泳仪，北京六一公司；G2938A 生物分析仪，美国安捷伦公司；QuantiFluor -ST微型荧光剂，普洛麦格公司。1.2 试验方法1.2.1 茶叶取样于 2020 年 4 8 月，在制茶过程选取发
13、酵过程中 7 个关键节点（MC S6）采样：分别为初制黑毛茶（MC）、渥堆发酵第一次翻堆 7 d（S1）、第二次翻堆 14 d（S2）、第三次翻堆23 d（S3）、第四次翻堆 31 d（S4）、第五次翻堆 45 d（S5）和成品 76 d（S6）。在茶堆每次翻堆补水前进行取样，取茶堆上层、中层以及底层由表及里 30 50 cm 处茶叶，每层选 3 个点各取 200 g 混匀，所有茶叶样品使用无菌袋封装，置于冰盒带回实验室，存于-80冰箱。1.2.2 藏茶微生物组总 DNA 提取与检测按照 E.Z.N.A.Soil DNA Kit 说明书，对藏茶各个样品的微生物总 DNA 分别进行提取与检测，通
14、过 0.8%AGE 和酶标仪进行分子大小判断和定量。1.2.3 PCR 扩增及检测通过细菌 16S rRNA 引物 338F（5-barcode+ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3）、806R（5-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3）、真菌18S rRNA 前引物（5-CCAGCASCYGCGGTAA TTCC-3）和后引物（5-ACTTTCGTTCTTGATY RA-3）对细菌 V3 V4 区域和真菌 ITS 区域进Aspergillus was dominant.After isolation and purification,Aspergillus cristatus,
15、Aspergillus awamori and Aspergillus oryzae were identified from Tibetan tea.Proteus,firmicutes,actinomycetes and Bacteroides were the dominant bacteria,and there were no stable dominant bacteria in the whole fermentation process.Key words：Tibetan tea,Fermentation,Illumina MiSeq technology,Microbial
16、community diversity,Aspergillus第 50 卷茶 叶 通 讯106行扩增。体系见表 1。真菌扩增程序：通过 2%琼脂糖凝胶回收 PCR 产物，使用Axygen DNA Gel Extraction Kit 回收目的片段。1.2.4 PCR 产物定量、混样、文库构建及 MiSeq测序利用 Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 对 PCR 产 物 在 Microplate reader（BioTek，FLx800）上进行定量，然后按照每个样品所需的数据量进行混样。利 用 TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit进行建库，通过 2%琼脂糖凝胶电泳来对文库做最终的片段选择与纯化12。在 Agilent Bioanalyzer 仪 器 上 使 用 Agilent High Sensitivity DNA Kit对文库做2100质检，利用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 在 Promega QuantiFluor 上进行定量。对合格的文库，通过MiSeq机器上利用MiSeq