1、2.4线性关系精密量取乙醇标准储备液用水定量稀释制成 0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 gmL1的溶液，分别进样，记录峰面积。结论:乙醇在 0.1 20.2 gmL1的浓度范围内浓度与峰面积呈良好的线性关系(回归方程 y=0.7515x+0.0772，2=0.9996)。按 S/N3 计算检出限，即乙醇的检出限分别为 11.4 ngmL1。2.5重复性试验取样品(批号:20191001)0.5 g，置顶空瓶中，加对照品溶液(浓度 5.05 gmL1)5 mL，溶解样品，测定含量。平行制备 6 份，结果 6 分样品中乙醇平均含量为5.26 gmL1，SD 2.1%。2.
2、6稳定性试验取样品(批号:20191001)5 g，用对照品溶液(浓度 5.05 gmL1)稀释并定容至 50 mL 量瓶中。再精密量取上述溶液 5.0 mL，于 0、3、5、9、12、24 h 进样。结果:供试品溶液 24 h 内乙醇峰面积的 SD 为 2.68%(n=6)。2.7回收率试验取样品(批号:20191001)约 0.5 g，共 6份，置顶空瓶中，精密加 2.02 gmL1的乙醇溶液 5 mL，注入 GC-MS/MS 仪，测定并计算回收率。结果:乙醇回收率均值为 104.78%，SD 为 2.67%。2.8样品测定依法测定 54 批硬脂酸样品，结果 54 批样品中均未检出乙醇残留
3、。3讨论3.1色谱柱考察本研究考察了实验室中常用的毛细管色谱柱(如 DB-624 ms、DB-1 ms 等)。选用 DB-624 ms 毛细管柱进行分离时，乙醇峰与内标(丙酮)峰分离效果最好，故本试验选用 DB-624 ms 毛细管柱为色谱柱。3.2质谱条件的选择取 10 gmL1的乙醇溶液，进行MS1 Scan 模式全扫描，选择丰度最高的离子作定量离子(乙醇为 31.0，丙酮为 43.0)，丰度较高的离子作定性离子(乙醇为 31.0、46.2，丙酮为 43.0、58.2)，按照 SIM 扫描模式进行检测。3.3平衡温度和平衡时间的考察本研究考察了不同温度下乙醇的响应情况8-10。结果显示乙醇
4、响应值在温度升至 90以后，响应值变化不明显。故最终选择 90 作为最佳的平衡温度。另发现在一定时间内乙醇响应值随着平衡时间的增加而增加，当时间超过 20 min 后，响应值变化较小，故最终选择 20 min 作为最佳的平衡时间。3.4国内市场中不同级别硬脂酸质量情况52 批硬脂酸样品中均未检出乙醇。说明国内市场中工业级及药用辅料硬脂酸整体质量良好，乙醇残留量较低;并且以乙醇进行结晶的精制工艺中，各企业对其工艺控制也较好，并未显著增加药用辅料级硬脂酸的乙醇残留。但辅料级硬脂酸工艺中确需大量使用乙醇重结晶，稍有不慎将会残留。故，企业生产过程中仍需重点关注乙醇残留情况，加强药品质量监控。参考文献1
5、 方桂花，赵茂森，于孟欢，等.硬脂酸复合相变材料的研究进展J.化工新型材料，2022，50(2):5-10.2 刘芳，张亦红，陈风春，等.气相色谱法测定硬脂酸镁中硬脂酸和棕榈酸的含量 J.解放军预防医学杂志，2015，33(1):2-7.3 国家药典委员会编.中国药典(四部)S.北京:中国医药科技出版社，2020:116-120.4 李敏，杨文智，黄晓龙，等.国际人用药品注册技术协调会仿制药国际协调进展 J.中国临床药理学杂志，2020，36(16):4-10.5 张文锦，后小龙，付宁.加速溶剂萃取-GC-MS/MS 法检测土壤中5种有机氯农药残留 J.食品工业，2020，41(7):4-11
6、.6 黄斌，史群志，李景，等.顶空毛细管气相色谱法测定伏立诺他原料药中有机溶剂残留量 J.中南药学，2018，16(1):4-10.7 朱克旭，张海波.顶空毛细管气相色谱法测定索非布韦原料药中有机溶剂残留量 J.中南药学，2019，17(7):3-8.8 洪宗超，吴和珍，杨艳芳，等.基于 GC-MS 及 GC 技术对片姜黄挥发油成分的定性定量分析 J.中南药学，2019，17(3):9-14.9 宁亚维，侯琳琳，于同月，等.UPLC-MS/MS 法快速测定乳酸菌发酵食品中的苯乳酸 J.食品与发酵工业，2021，47:174-179.10 柳华春，梁文耀，王继才，等.顶空气相色谱-质谱联用法测定
7、化妆品中-氯甲苯 J.分析测试学报，2021，40(8):5-11.作者简介:陈媛琴，女(1999 )。药学专业学士。通讯作者:吴玉水，男(1963 )。学历:博士。职称:教授。研究方向:生物技术药物。基因工程重组表达血管内皮生长因子的纯化与初步应用陈媛琴，田竣元，黄娟，蔡威，吴玉水*(福建基诺厚普生物科技有限公司，福建莆田 351100)摘要:目的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)可有效促进血管新生和增加血管通透性，是参与多种生理和病理过程的重要因子。通过基因工程重组表达 VEGF165a并进行蛋白纯化，同时建立免疫学活性检测方
8、法，可用于检测开发的生物类似药雷珠单抗的药物活性。方法通过对基因工程构建的 rhVEGF165a工程菌进行均质破菌，得到不可溶的包涵体，并进行包涵体的增溶与变性。通过镍柱亲和层析方法，从尿素溶解的包涵体中有效地复性和纯化 rhVEGF165a。以纯化的 rhVEGF165a建立 ELISA 分析方法，用于所开发的生物类似药雷珠单抗活性检测。结果纯化后的 rhVEGF165a为天然的二聚体形式，分子量约为 40kDa;成功获得纯度达到 95%以上的 rhVEGF165a蛋白;间接 ELISA 结果表明，所研发的生物类似药雷珠单抗与原研雷珠单抗具有相同的药物活性。结论本研究所获得的纯化 rhVEG
9、F165a蛋白以及建立的间接ELISA 检测方法，可用于开发的生物类似药雷珠单抗的药物活性分析。35Strait Pharmaceutical Journal Vol.35 No.2 2023关键词:血管内皮生长因子;雷珠单抗;纯化;ELISA中图分类号:917文献标识码:B文章编号:1006-3765(2023)-02-0053-05Purification and Preliminary Application of Genetically Engineered ecom-binant Vascular Endothelial Growth FactorCHEN Yuan-qin，TIAN
10、 Jun-yuan，HUANG Juan，CAI Wei，WU Yu-shui*(Fujian Genohope Biotech Ltd.，Putian 351100，China)ABSTACT:OBJECTIVEVascular endothelial growth factor(VEGF)effectively promotes vascular neovascular-ization and increases vascular permeability，and is involved in a variety of physiological and pathological proc
11、esses asimportant factor.The recombinant expression of VEGF165aby genetic engineering and protein purification，as well asthe establishment of an immunological activity assay，can be used to detect the drug activity of the developed biosimi-lar Lucentis.METHODSThe genetically engineered E.coli thalli
12、of rhVEGF165awere homogenized to obtain insol-uble inclusion body(IB)，followed by solubilizing and denaturalization of IB.The rhVEGF165awas efficiently refoldedand purified from the urea-soluble inclusion body by nickel column affinity chromatography.An ELISA assay was es-tablished for the activity
13、assay of the developed biosimilar drug Lucentis.ESULTSThe purified rhVEGF165ais thenatural dimeric form with a molecular weight of about 40 kDa.rhVEGF165awith a purity of over 95%was obtainedsuccessfully.The indirect ELISA results showed that the developed Lucentis and the original ranibizumab had t
14、hesame drug activity.CONCLUSIONThe purified rhVEGF165aprotein obtained from this study and the indirectELISA established could be applied to analyze the drug activity of the developed biosimilar Lucentis.KEY WODS:Vascular endothelial growth factor;Lucentis;Purification;ELISA在生物药的研发过程中，检测某药物是否具有药物活性是
15、评估其能否产生预期药效作用的重要一步。生物类似药雷珠单抗能够与血管内皮生长因子(VEGF)的活性部位结合，因此雷珠单抗药物活性分析可通过检测单抗与 VEGF165a的结合活性来判断。目前，市面上的 VEGF 蛋白来源有限，主要为国外进口产品，价格昂贵;国内报道大多数以原核形式表达，但纯化后获得的蛋白主要以单体形式存在1，2。因此，建立高效的纯化方法，纯化后获得天然二聚体形式高纯度、高活性VEGF165a蛋白至关重要，具有重要的实用价值。本研究选用基因工程重组构建的 rhVEGF165a工程菌，其目的蛋白以包涵体的形式在大肠杆菌中高效表达，通过对包涵体的增溶和变性，并选用镍柱3对 rhVEGF1
16、65a蛋白进行柱上复性纯化，获得天然的二聚体蛋白，纯度高且具有良好的生物学活性。利用纯化的 rhVEGF165a蛋白建立间接 ELISA 分析方法，用于所开发生物类似药雷珠单抗的药物活性检测。1材料与方法1.1材料rhVEGF165a工程菌由福建基诺厚普生物科技有限公司研发实验室构建及发酵表达(80 保存菌块，发酵批号:20201119);考马斯亮蓝-250(上海麦克林生化科技有限公司);30%丙烯酰胺制胶液和牛血清白蛋白(Solarbio 公司);蛋白 marker(SIGMA 公司);原研雷珠单抗注射液(诺华制药公司，批号:20G14PG);雷珠单抗(生物类似物)由福建基诺厚普生物科技有限公司自制(批号:20220216)。TMB 显色液(阿拉丁试剂有限公司);吐温-20(西陇科学有限公司);Goat anti-Human IgG(HL/HP)(北京博奥森生物技术有限公司)，Ni Crystarose 6FF 胶体(武汉晶诚生物科技股份有限公司)。超纯水机(美国艾科浦国际有限公司);高压均质机(美国 TAS 公司);台式高速冷冻离心机(长沙湘智离心机仪器有限公司);酶标仪(美国宝特