1、DOI:10.12131/20220226文章编号：20950780（2023）02015011 研究简报 光裸星虫 SERCA 基因克隆及在卵母细胞中的表达分析苏泳霖1，钟如卓1，郭志诚1，王庆恒1,2,31.广东海洋大学 水产学院，广东 湛江 5240882.广东省海水养殖生物育种工程实验室，广东 湛江 5240883.广东省水产动物病害防控与健康养殖重点实验室，广东 湛江 524088摘要：细胞内钙离子(Ca2+)浓度的变化是介导卵母细胞成熟的重要因素。肌质网/内质网Ca2+-ATP酶(Sarco/endoplasmicreticulum calcium adenosine tripho
2、sphatase,SERCA)属P型ATP酶家族成员，是细胞内Ca2+转运的重要调控蛋白。前期转录组分析显示，光裸星虫(Sipunculus nudus)SERCA(Sn-SERCA)的表达量在卵母细胞发育过程中差异显著，为进一步研究SERCA在卵母细胞不同发育阶段中的作用，利用RACE技术得到Sn-SERCA cDNA全长，采用实时荧光定量PCR检测Sn-SERCA在各卵母细胞发育时期的相对表达量。结果表明，Sn-SERCA全长为3 840 bp，5非编码区(UTR)为196 bp，3UTR为581 bp，开放阅读框3 060 bp，编码1 020 个氨基酸，Sn-SERCA具有P型ATP酶
3、家族进行催化反应所需的两个保守基序“TGES”和“DKTGT”。多序列比对、Motif分析及三级结构预测结果显示SERCA同源蛋白具有较高保守性。系统进化树分析表明Sn-SERCA与粉正蚓(Lumbricus rubellus)、鸭嘴海豆芽(Lingula anatine)等无脊椎动物同源蛋白序列聚为一支。荧光定量结果显示：卵母细胞在体腔液中发育时，Sn-SERCA在卵黄旺盛合成后期高表达；当卵母细胞进入肾管后，Sn-SERCA的表达量大幅上升，显著高于其他时期(P0.05)。结合前期卵母细胞发育的超微结构观察，研究结果表明Sn-SERCA在光裸星虫卵母细胞的卵黄积累和生发泡破裂发生过程中起重
4、要作用。关键词：光裸星虫；SERCA 基因；卵母细胞；表达分析中图分类号：S 917.4文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Cloning and expression analysis of SERCA gene of Sipunculus nudus inoocytesSUYonglin1,ZHONGRuzhuo1,GUOZhicheng1,WANGQingheng1,2,31.Fisheries College,Guangdong Ocean University,Zhanjiang 524088,China2.Guangdong Provincial Enginee
5、ring Laboratory for Mariculture Organism Breeding,Zhanjiang 524088,China3.Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture,Zhanjiang 524088,ChinaAbstract:The change of intracellular calcium(Ca2+)concentration is an important factor in oocyte maturation.As a m
6、emberof the P-type ATPase family and a crucial regulator of intracellular calcium transport,sarco/endoplasmic reticulum calciumadenosine triphosphatase(SERCA)is a key enzyme.To investigate the function of SERCA in the development of the oocytes ofSipunculus nudus,we obtained the full length of S.nud
7、us SERCA(Sn-SERCA)cDNA by using RACE technique,and determinedthe Sn-SERCA relative expression level in different oocyte developmental periods by using real-time fluorescence quantitativePCR(qRT-PCR).The results indicate that the overall length of the Sn-SERCA was 3 840 bp,the 5UTR was 196 bp,the 3UT
8、R第 19 卷第 2 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.22023 年 4 月South China Fisheries ScienceApr.，2023收稿日期：2022-08-24；修回日期：2022-10-13基金项目：湛江市科技计划项目(2021A05190)；广东省科技计划项目(GDKTP2020046400,163-2019-XMZC-0009-02-0059)作者简介：苏泳霖(1998)，女，学士，研究方向为水产养殖。E-mail:通信作者：王庆恒(1977)，男，教授，硕士，研究方向为无脊椎动物生物学与养殖技术。E-mail:was 581 bp,and the op
9、en reading frame was 3 060 bp,encoding 1 020 amino acids.Sn-SERCA had TGES and DKTGT whichwere the P-type ATPase familys two conserved motifs and were necessary for catalytic reactions.According to multiple sequencealignment,motif analysis,and predictions of tertiary structures,the SERCA homologous
10、proteins exhibited great conservatism.The phylogenetic tree analysis shows that the Sn-SERCA formed a broad branch with homologous protein sequences from inver-tebrates such as Lumbricus rubellus and Lingula anatine.The result of qRT-PCR demonstrates that the Sn-SERCA was signifi-cantly expressed in
11、 the late yolk vigorous synthesis period and had the maximum value during coelomic fluid development.When the oocytes moved to the nephridioduct,the Sn-SERCA expression was considerably higher than that at other time(P0.05).The variable expression of Sn-SERCA in different periods of oocyte developme
12、nt suggests that Sn-SERCA is crucial inthe development and germinal vesicle breakdown in S.nudus oocytes.Keywords:Sipunculus nudus;SERCA gene;Oocytes;Expression analysis光裸星虫(Sipunculus nudus)俗称沙虫，又名裸体方格星虫，为星虫动物门的常见种类，在中国海南、广东、广西等地的沿海潮间带均有分布，其中广西北海至广东湛江遂溪一带资源量较为丰富1-2。光裸星虫具有较高的经济、营养与生态价值，2020 年后逐渐成为中国
13、北部湾沿岸的一种新兴养殖品种3-4。目前，关于光裸星虫工厂化养殖以及育苗等技术已有报道5-6，但较于其他人工养殖技术成熟的水产品种，光裸星虫的人工繁育与养殖技术还有很大的提升空间。人工苗种严重短缺是目前制约光裸星虫养殖产业发展的瓶颈之一。现在生产上多采用物理刺激方法诱导光裸星虫排放生殖细胞，诱导成功率、排放时间和排放量很不稳定。光裸星虫无肉眼可见的性腺，卵母细胞游离于体腔液中发育。在生殖季节，其体腔液中存在大量已经完成物质积累的卵母细胞。但是，利用这些卵子进行解剖受精却未获成功。已有研究表明这些卵子必须进入肾管，在肾管中发生生发泡破裂(Germinalvesiclebreakdown,GVBD
14、)，而后才具备受精能力，即 GVBD 的发生是光裸星虫卵母细胞成熟即具备受精能力的前提7。因此，深入认识光裸星虫卵母细胞 GVBD 的发生机制，建立人工诱导 GVBD 的方法，才有望实现利用解剖所得卵细胞进行人工授精，从而实现大规模的同步育苗生产。细胞内钙离子(Ca2+)浓度的变化是介导卵母细胞成熟的重要因素 8-1 0。胞内 Ca2+振荡影响减数分裂重启、GVBD 发生及蛋白质合成等生化反应进程8。作为真核细胞内主要的钙离子泵(Calciumpump)之一，肌质网/内质网Ca2+-ATP 酶(Sarco/endoplasmicreticulumcalciumadenosinetriphosp
15、hatase,SERCA)利用 ATP 水解所产生的能量，将胞质内的 Ca2+转运至肌质网/内质网(Sarcoplasmicreticulum,SR/endoplasmicreticulum,ER)中，并将内质网中的质子转运至胞质中，从而维持胞质与 SR/ER 之间 Ca2+浓度的动态平衡11-12。SERCA 属于 P 型 ATP 酶家族(P-typeATPasefamily)。P 型 ATP 酶家族的成员蛋白是位于各种类型膜(例如质膜或细胞器膜)中的膜蛋白，它们与阳离子、重金属离子和脂质的运输相关，形成并维持细胞正常生理活动所需的化学势梯度13-15。目前在人类中已发现并鉴定出3 种同源基
16、因编码 SERCA，分别为 SERCA1、SERCA2、SERCA3，这 3 种基因在转录翻译过程中通过选择性剪接产生多种异构体，包括 SERCA1a-b、SERCA2a-d、SERCA3a-f16。近年，SERCA 基因在克氏原螯虾(Procambarus clarkii)17、合浦珠母贝(Pinctada fucata)18、蓝蟹(Callinectes sapi-dus)19等常见的无脊椎水产经济动物中已有相关报道。在卵母细胞成熟过程中，胞外钙内流和/或胞内钙释放介导短暂的 Ca2+促进 GVBD20-21。SERCA 在此期间，负责将由肌醇三磷酸受体(Inositol1,4,5-trisphosphatereceptor,IP3R)从内质网中转运到细胞质的 Ca2+重新泵回内质网22。结合此前对光裸星虫卵母细胞转录组数据的分析，SERCA 在光裸星虫卵母细胞 GVBD 发生时期的表达量相较于生发泡(Germinalvesicle,GV)时期显著上升，推测其可能在卵母细胞发育过程中起重要作用23。本研究采用RACE 克隆技术得到光裸星虫 SERCA(Sn-SERCA)的序列全长，