1、第36卷第1期2023年3月Vol.36 No.1Mar.2023海南师范大学学报（自然科学版）Journal of Hainan Normal University（Natural Science）二维液相色谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中的维生素A、D、E李莲1,2,3，黄柳霞1,2,3，罗雪婷1,2,3（1.广东省食品工业公共实验室，广东广州511442；2.广东省食品工业研究所有限公司，广东广州511442；3.广东省质量监督食品检验站，广东广州511442）摘 要：本文建立了二维液相色谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中维生素A、E、D含量。样品经皂化、萃取、浓缩、定容，经二维反相色谱法测定，对
2、所建立的方法进行方法学验证，结果表明：维生素A、D、E标准曲线线性良好，R20.999，维生素A、E、D检出限分别为8、0.65、30 g/100 g；定量限分别为25、2、100 g/100 g，加标回收率为87.3%96.5%，RSD为0.45%3.80%，同时与国标法进行比较，该方法更加简便快捷，灵敏度高，结果也相对较准。关键词：二维液相色谱法；维生素A；维生素D；维生素E；婴幼儿配方奶粉中图分类号：O657.72;TS252.51 文献标志码：A 文章编号：1674-4942（2023）01-0046-07Simultaneous Determination of Vitamin A,
3、D and E in Powdered Infant Formula by Two-dimensional Liquid ChromatographyLI Lian1,2,3，HUANG Liuxia1,2,3，LUO Xueting1,2,3（1.Guangdong Provincial Public Laboratory of Food Industry，Guangzhou 511442，China；2.Guangdong Food Industry Institute Co.Ltd.，Guangzhou 511442，China；3.Guangdong Quality Supervisi
4、on food Inspection Station，Guangzhou 511442，China）Abstract:In this paper,two-dimensional liquid chromatography was established to simultaneously determine the content of vitamins A,E and D in powdered infant formula.The samples were saponified,extracted,concentrated,volumed,anddetermined by two-dime
5、nsional reversed-phase chromatography,and the established method was verified methodologically,and the results showed that the standard curves of vitamin A,D and E were linear with R20.999,the detection limits of vitamins A,E and D were 8,0.65,30 g/100 g.The quantitative limits were 25,2,100 g/100 g
6、,the recovery rate of spiked were 87.3%96.5%,and the RSD were 0.45%3.8%.Compared with the national standard method,the method was simpler and faster,with high sensitivity and relatively accurate results.Keywords:two-dimensional liquid chromatography;vitamin A;vitamin D;vitamin E;infant formula维生素是人和
7、动物为维持正常的生理功能而必须从食物中获得的一类微量有机物质，在机体生长、代谢、发育过程中发挥着重要作用。维生素又分为脂溶性和水溶性，脂溶性维生素主要包括维生素A、D、E等。维生素A对婴幼儿的骨骼和视力发育起到重要作用，还能增强机体造血功能；维生素E具有抗氧化、抗衰老、调节免疫力等作用，、是其4种异构体，其中-维生素E分布最广；维生素D在人体内可以起到钙磷调节的作用，可防止佝偻病、骨质疏松，主要有维生素D3与D2。但另一方面，由于该类脂溶性维生素不易通Doi：10.12051/j.issn.1674-4942.2023.01.007收稿日期：2022-11-05第一作者：李莲（1993），甘肃
8、白银人，助理工程师，研究方向为食品安全与检测。E-mail：李莲，等：二维液相色谱法同时测定婴幼儿配方奶粉中的维生素A、D、E第1期过尿液排出体外，摄入过量时容易蓄积，久而久之引起多种脏器组织病变。综上所述，维生素A、D、E是婴幼儿生长发育的必须营养素，且摄入量须控制在一定范围内，缺乏或过量均会引起代谢失衡以至于出现健康问题。随着社会的快速发展，各类婴幼儿配方奶粉应运而生，以起到在母乳不足时有效补充的作用，而维生素A、D、E又是婴幼儿奶粉中重要的营养成分，且其化学性质不稳定，易受光照氧化分解，因此，准确而快速检测其含量已成为质量控制中的一个重要环节1-2。目前，脂溶性维生素A、D、E通常采用液
9、相色谱法进行检测，本文参考 食品安全国家标准食品中维生素A、D、E的测定（GB 5009.82-2016）3并在此基础上改善方法，采用二维液相色谱法，将基质复杂、含量较低的维生素D通过一维色谱柱在线净化并直接切换到二维色谱柱进行准确定量，可同时检测婴幼儿配方奶粉中维生素A、D、E，缩短了前处理时间，极大提高了检测效率。1 材料与方法 1.1 试剂与仪器乳清蛋白粉，市售；婴幼儿配方奶粉中维生素A、D、E定量分析质控样品，中国检验检疫科学研究院测试评价中心；10批婴幼儿配方奶粉，市售。无水乙醇（分析纯）、石油醚（分析纯）、无水乙醚（分析纯），天津市康科德科技有限公司；乙腈（色谱纯）、甲醇（色谱纯）
10、，上海星可高纯溶剂有限公司；抗坏血酸（分析纯），天津市天新精细化工开发中心）、2，6-二叔丁基对甲酚（BHT），上海麦克林生化科技有限公司；氢氧化钾（分析纯），广东广试试剂科技有限公司；氢氧化钾溶液中水 氢氧化钾=1 1。混合醚液中石油醚 无水乙醚=1 1。实验中所用的水为一级水。标准品：维生素A（全反式视黄醇），FirstStandard公司；-维生素E、-维生素E、-维生素E（DL-生育酚）、-维生素E，TMstandard公司；维生素D3、维生素D2，BePure公司。U-3000液相色谱仪（配有UV检测器），美国赛默飞世尔科技公司；TU-1810PC型紫外可见分光光度计，北京普析通用仪
11、器有限责任公司；AutoEVA-60型全自动平行浓缩仪，厦门睿科仪器有限公司；分液漏斗萃取净化振荡器，北京同泰科技有限公司；Milli-Q Advantage A10纯水机，默克密理博公司。1.2 标准溶液配制参照文献3，配制维生素A、D、E混合标准曲线，维生素A浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、6.0 g/mL；、-维生素E浓度为 2.0、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0 g/mL；维生素D2、D3浓度为0.02、0.05、0.10、0.20、0.40、0.60 g/mL。1.3 试样前处理样品前处理依旧参照文献3第一法，称取10.000 g混合均匀的试样于锥形瓶中
12、，加1.0 g抗坏血酸和0.1 g BHT，加入8.0 mL水，涡旋混匀，加40 mL无水乙醇与30 mL氢氧化钾溶液，边加边摇，80 恒温水浴振荡（160170 r/min）皂化30 min，随即放入冰水中冷却。将皂化液转移至分液漏斗中，用少量水润洗锥形瓶，一并倒入分液漏斗中，加130 mL混合醚，振荡萃取5 min，静置分层，弃掉下层溶液，用50 mL水洗涤醚层，约需重复4次，至下层流出水溶液呈中性，去除下层水溶液。将醚层转移至100 mL氮吹管中，放进全自动平行浓缩仪中，40 氮吹至近干立即拿出，用甲醇分次将氮吹管中残留物溶解并转移至10 mL容量瓶中，定容至刻度，摇匀压滤待测。1.4
13、方法验证过程随机购买10批婴幼儿配方奶粉，按照国标法和上述前处理过程以及上述前处理过程中的2次萃取进行处理，平行2份，进行结果比对。购买乳清蛋白粉（空白样），按照上述前处理过程进行3个不同梯度加标回收实验，平行2份，上机测定。购买婴幼儿配方奶粉中维生素A、D、E定量分析质控样品，按照国标法和上述前处理过程进行处理，平行2份，进行结果比对。1.5 色谱条件经过反复验证，一维分析方法流动相的选择依旧参考国标液相法，通过调整甲醇比例，使维生素E的4种同分异构体有效分离；二维分析方法中，为了使维生素D2与D3完全分离，国标法效果并不是特别理想，尤472023年海南师范大学学报（自然科学版）其最低点基线
14、较差，考虑到乙腈的吸光度值低，洗脱能力强，产生的噪声小，在流动相的选择上，同时使用乙腈和甲醇，可以改变选择性以获得较好的分离效果，通过调整比例，从而得到如下的色谱条件。一维色谱柱 FOODKIT 2 ADE（4.6 mm150 mm，2.6 m），二维色谱柱 FOODKIT 1&2 ADE（4.6 mm100 mm，2.6 m）。流速：0.5 mL/min（一维分析泵），0.8 mL/min（二维分析泵）。柱温：30。检测波长：325 nm（维生素A）、294 nm（维生素E）、264 nm（维生素D）。进样量：10 L。流动相条件详见表1。2 结果与分析 2.1 食品中维生素A、D、E检验的
15、其他方法随着社会的快速发展，人们对各类食品中营养成分的关注度越来越高，同时检测维生素A、D、E的方法也应运而生4-7。有采取有机溶剂超声直接提取的前处理方式，再经双三元液相色谱分析的模式，对其含量进行检测。此次实验的过程中，也尝试此种前处理方式，发现只有基质简单，维生素A、D、E含量较高的样品可用，比如保健品，因为前处理过程太过简单，并不能除脂，不适用于奶粉的检测。也有的按照上述国标法，皂化提取后，用固相萃取法代替液液萃取的方式，或直接用有机溶液定容皂化液，压滤上机，二者均利用双梯度泵系统，需要紫外检测器和荧光检测器同时使用，可一次同时完成定量分析，前方式较为新颖，处理过程的不确定因素，可有待
16、于进一步论证；后一种方式中，皂化液未被萃取以及水洗，故而样品pH太高且杂质较多，长期使用对检测器的流通池以及色谱柱并不友好，需要花费较多维护成本。综上所述，此次实验的前处理过程依旧采用液液萃取的方式，因为萃取振荡器和氮吹仪的加入，前处理过程并未花费多余精力，经过近3年500批次样品的实际论证，标准溶液峰面积、加标回收率均在正常范围，仪器、色谱柱依旧正常使用。2.2 前处理条件的优化经过反复验证，优化措施如下：（1）对于水的加入量，发现加入标准方法中的2030 mL时，萃取完乳液较多，分层不彻底，需要较长的时间静置等待分层，故需减少水的加入量至810 mL即可；（2）所加入的试剂均要按顺序且摇匀，防止皂化结束有结块，皂化时间保持30 min左右，实验发现，延长皂化时间会导致皂化液分成3层，维生素D转化为前体，从而使结果偏小，为了保证皂化完全，可加大无水乙醇和氢氧化钾的量，因为脂溶性维生素大多以酯类形式加入奶粉中，故而样品需先皂化完全，使酯类完全转化为游离型；（3）水洗后，醚层越透明无色则可证明皂化、萃取过程越完善；（4）本方法在萃取时发现加大混合醚至130 mL左右，1次萃取与2次萃取结