1、论著基础研究第一作者简介：丁小琼，本科，主治医师，研究方向：心内科疾病诊治。通信作者简介：张志敏，博士，主治医师，研究方向：心内科疾病诊治。不同剂量万古霉素对慢性心力衰竭大鼠心功能、肾功能及神经内分泌因子的影响及其血药浓度变化丁小琼 王清传 王元标 张志敏（新疆军区总医院 派驻门诊部，干部保健科，心内科，新疆乌鲁木齐市）【摘要】目的 探讨不同剂量万古霉素对慢性心力衰竭（）大鼠心功能、肾功能及神经内分泌因子的影响及其血药浓度变化。方法 取 只大鼠作为假手术组。取 只大鼠建立 模型，将 只造模成功的大鼠随机分为 组（只）、低剂量万古霉素组（只）、中剂量万古霉素组（只）、高剂量万古霉素组（只）及药物
2、对照组（只）。分别给予低剂量万古霉素组、中剂量万古霉素组、高剂量万古霉素组大鼠经尾部注射 、的万古霉素，给予药物对照组大鼠卡托普利灌胃，给予假手术组和 组大鼠等体积生理盐水灌胃。检测各组大鼠心功能指标左心室舒张末期内径（）、收缩末期内径（）、左心室射血分数（）和左室短轴缩短率（）、肾功能指标血清肌酐、血清尿素氮和 尿蛋白（）、神经内分泌因子血清血管紧张素（）、醛固酮和心钠素水平；采用 染色观察各组大鼠心肌组织、肾组织的病理学变化；采用 检测各组大鼠心肌组织、醛固酮和心钠素的蛋白表达水平；采用吸波面积法检测不同剂量万古霉素组的血药浓度。结果（）与假手术组相比，组大鼠的、血清肌酐水平、血清尿素氮水
3、平和 水平均升高，、均降低（均 ）；与 组相比，各剂量万古霉素组大鼠的、血清肌酐水平、血清尿素氮水平和 水平均降低，、均升高（均 ），除肾功能指标外，其余指标总体上均呈剂量依赖性变化。（）染色结果显示，组大鼠心肌细胞水肿，细胞浆染色加深，细胞体积缩小，可见空泡；肾小球间质增加，肾间质增宽。各药物干预组大鼠的心肌组织和肾脏组织损伤均有所减轻，其中高剂量万古霉素和药物对照组大鼠心肌损伤的改善最为显著，中剂量万古霉素组及药物对照组大鼠肾组织损伤的改善最为显著。（）与假手术组相比，组大鼠血清、醛固酮和心钠素水平，以及心肌组织、醛固酮和心钠素蛋白表达水平均升高（均 ）；与 组相比，各剂量万古霉素组大鼠血
4、清 、醛固酮和心钠素水平，以及心肌组织 、醛固酮和心钠素蛋白表达水平均降低（均 ），总体上呈剂量依赖性变化。（）万古霉素血药浓度分析结果显示，低剂量万古霉素组的血药浓度在用药后 时达到峰值（），在用药后 时血药浓度为；中剂量万古霉素组的血药浓度在用药后 时达到峰值（），在用药后 时血药浓度为；高剂量万古霉素组的血药浓度在用药后 达到峰值（），在用药后 、及 时血药浓度较稳定。结论 不同剂量万古霉素均可改善 大鼠的心功能与肾功能指标，其作用机制可能与抑制神经内分泌因子、醛固酮和心钠素的表达水平有关；高剂量（）万古霉素对 大鼠的心功能和心肌组织损伤的改善作用最佳，且血药浓度更为稳定，但对肾脏有一定
5、损伤；中剂量（）万古霉素对 大鼠的肾功能的改善作用最佳。【关键词】慢性心力衰竭；万古霉素；心功能；肾功能；神经内分泌因子；血药浓度；大鼠【中图分类号】【文献标识码】【文章编号】（）：广西医学 年 月第 卷第 期 ，（，）【】，（），（），（），（），（）（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），（），；，（），（），（），（）（），；（），；，（），（），；，（）【】，慢性心力衰竭（，）是心脏疾病发展至终末期的临床综合征，发病机制与心肌长期缺血导致心脏结构改变，心脏血流灌溉不足而无法维持组织代谢导致静脉系统淤血有关。持续存在的心力衰竭状态可导致心肌重构，增加患者猝死的风险。发
6、生后心脏结构及功能改变会导致心室射血能力受损，主要表现为心室收缩能力减弱而不能满足机体代谢所需，因此提高心室收缩能力对于改善 患者的预后具有重要意义。的病理生理机制复杂，在对心脏功能产生影响的同时，还对肾脏、骨骼、内分泌及免疫系统产生影响。发生后，机体交感神经兴奋性增加，可导致循环系统中的血管紧张素（，）等因子表达异常，使心率加快、心肌耗氧量增加，促使心肌细胞凋亡与心脏重塑。因此，明确 患者神经内分泌相关因子表达水平的变化情况可为 的治疗提供新方向。目前，的发病人群以中老年人群为主，这类人群机体免疫力较低，更容易感染外界病原菌，进而出现病情加重，因此，给予抗感染药物治疗将有助于控制疾病进展。有
7、学者发现，采用万古霉素进行抗感染治疗可以改善 患者的临床疗效，但是长期使用不良反应较大，且随着万古霉素剂量的增加，其血药浓度升高，对患者肾脏损伤较大。因此，本研究探讨不同剂量万古霉素对 模型大鼠的心功能、肾功能和神经内分泌因子水平的影响及其血药浓度变化，以期为临床用药选择提供参考。材料与方法 实验动物 只无特定病原体 大鼠由基尔顿生物科技（上海）有限公司提供动物许可证号：（上），雌雄各半，体重 ，将大鼠饲养于动物房内，每 只分笼饲养，光暗循环，无菌饮食喂养 周，按照实验动物管理条例规定进行实验。所有涉及动物的操作严格遵循实验动物伦理要求。主要药物、试剂与仪器 青霉素（天津华津制药有限公司，批号
8、：），盐酸万古霉素注射液 （）公司，批号：，卡托普利（广州迈特兴华制药厂有限公司，批号：）。二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，批号：），抗体（公司，批号：），苏木精伊红试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号：），脲酶比色法试剂盒（公司，批号：），苦味酸比色法试剂盒、试剂盒、醛固酮 试剂盒、心钠素 试剂盒齐一生物科技（上海）有限公司，批号：、，磺基水杨酸硫酸钠比浊法试剂盒（北京百奥莱博科技有限公司，批号：）。低温高速离心机河北慧采科技有限公司，型号：（）彩色多普勒超声诊断仪大为医疗（江苏）有限公司，型号：，荧光显微镜（苏州景通仪器有限公司，型号：），全自动生化分析仪（，型号：
9、），普通显微镜（公司，型号：），蛋白电泳仪（北京六一生物科技有限公司，型号：），小动物呼吸机（北京金洋万达科技有限公司，型号：）。大鼠模型的建立按随机数字表法选取 只大鼠，参考文献建立 模型，建模前采用彩色多普勒超声诊断仪对大鼠心脏进行检查，确保心功能正常。通过腹腔注射 戊巴比妥钠（）麻醉大鼠后将其仰卧位固定，连接小动物呼吸机，通气量为 ，呼吸频率为 次，将大鼠四肢连接心电监护电极，于左前第、肋间开胸，皮肤切口长度为，钝性分离各层组织直至暴露心脏，于距离主动脉根部 处采用 无创缝合丝线结扎冠状动脉左前降支，结扎后心室壁颜色变暗，心电图提示 段抬高伴 波高尖，视为结扎成功。逐层缝合皮肤，待大鼠恢
10、复自主呼吸后撤掉呼吸机。术后连续 使用青霉素（万）抗感染。周后进行心脏彩超检查，以左心室射血分数（，）为建模成功。只大鼠中，因感染导致死亡 只，其余 只大鼠建模成功。分组及干预方法将造模成功的 只大鼠按随机数字表法分为 组、低剂量万古霉素组、中剂量万古霉素组、高剂量万古霉素组、药物对照组，每组 只，剩余 只未造模的大鼠纳入假手术组（假手术组大鼠仅开胸暴露心脏，不结扎）。建模成功 后，分别给予低剂量万古霉素组、中剂量万古霉素组、高剂量万古霉素组大鼠尾部注射 、盐酸万古霉素注射液，次，连续干预；广西医学 年 月第 卷第 期药物对照组大鼠灌胃 卡托普利，次，次，连续干预 ；假手术组和 组灌胃等体积生
11、理盐水，次，连续干预 。观察指标 心功能指标：干预 后，各组大鼠禁食，不禁水。通过腹腔注射戊巴比妥钠（）麻醉大鼠后将其仰卧位固定，采用彩色多普勒超声诊断仪进行心功能检测，探头频率为 ，图像深度为 ，探查深度为 ，检测左心室舒张末 期 内 径（，）、收缩末期内径（，），依照文献的方法计算 和左室短轴缩短率（，）。连续检测 次，取平均值。肾功能指标：心功能指标检测结束后，采集大鼠眼眶静脉血 ，以 离心 后取上清液，采用脲酶比色法检查血清尿素氮水平，采用苦味酸比色法检测血清肌酐水平。在采血前 将大鼠分笼饲养收集尿液，采用磺基水杨酸硫酸钠比浊法检测 尿蛋白（，）水平。上述检测方法均严格按照试剂盒说明书
12、进行操作。血清、醛固酮和心钠素水平：心功能指标检测结束后，采集大鼠空腹眼眶静脉血 ，以 离心 后取上清液，采用 试剂盒检测血清、醛固酮及心钠素水平，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。组织病理学变化：完成上述指标检测后将大鼠麻醉处死，开胸取出心脏，分离心底大血管及右心室，生理盐水冲洗后用滤纸吸干，然后摘除肾脏，心脏及肾脏组织摘取过程中尽量减少机械损伤。心脏和肾脏组织经 甲醛固定过夜，石蜡包埋后制成 厚的切片，复温，二苯甲脱蜡后采用 乙醇梯度脱水，用蒸馏水冲洗 ，切片先放入苏木精染色 后再用小流量自来水冲洗，盐酸乙醇褪色变红后停止操作，再用 伊红复染 ，蒸馏水冲洗 ，乙醇脱水，二苯甲脱水透明，中性
13、树胶封固，在光学显微镜下观察心肌组织及肾脏组织的形态及结构。心肌组织、醛固酮和心钠素蛋白表达水平：取适量心肌组织样本，剪碎，加入预冷的 ，用组织匀浆器匀浆至无明显肉眼可见固体（或用液氮研磨），冰上静置 ，离心 后取上清液，采用二喹啉甲酸蛋白浓度测定试剂盒检测蛋白含量。将 蛋白加入 凝胶加样缓冲液中，加热处理 使蛋白变性。完成 后进行转膜，结束后取下硝酸纤维素膜，在 脱脂牛奶中 封闭 ，然后分别加入 抗体（深圳子科生物科技有限公司，货号：；稀释比为 ）、醛固酮抗体（艾美捷科技有限公司，货号；稀释比为 ）、心钠素抗体（上海恒远生化试剂有限公司，货号：；稀释比为 ），孵育过夜，然后使用 洗膜 次，次
14、，加入 辣根过氧化物酶标记二抗（北京博尔科技有限公司，货号：；稀释比为 ），温室孵育 ，洗膜 次，次。以（稀释比为 ）为内参蛋白，用 工作液显影后，采用 软件分析蛋白条带灰度值。实验重复 次。吸波面积法检测万古霉素血药浓度 对照品储备液的配制：将 盐酸万古霉素注射液置于 容量瓶，加入适量甲醇，超声，超声频率为 ，再加甲醇定容至 刻度线，摇匀，获得浓度为 的对照品储备液。专属性试验：取 大鼠空白血浆，加入 甲醇，涡旋 后以 离心。以甲醇作为参考，采用紫外可见分光光度法（北京中西华大科技有限公司生产的 型紫外可见分光光度计）在 波长处进行全波长扫描，获得空白血浆的全波长扫描图。将浓度为 的对照品储
15、备液 加入空白血浆中，再次按上述方法进行全波长扫描，获得含对照品储备液的血浆样品的全波长扫描图。将两个全波长扫描图进行比较，得到空白血浆与含对照品储备液的血浆样品之间的吸光度值差值，以此去除空白血浆中内源性物质和其他成分的干扰。标准曲线的建立：取 大鼠空白血浆，加入适量对照品储备液，分别制成浓度为 、的万古霉素样品溶液。采用紫外可见分光光度法在 波长处进行全波长扫描，采用 软件计算吸光度波长曲线下面积（，）。将加入甲醇的空白血浆作为对照（血浆 甲醇），再次按上述方法进行全波长扫描，获得，和 的差值为。以药物浓度为横坐标，以 为纵坐标，绘制标准曲线，并计算得出药物吸波面积与药物浓度线性回归方程：
16、药物浓度 （），药物浓度在 范围内则线性关系良好。精密度检测：取 大鼠空白血浆，加入适量对照品储备液，分别制成浓度为 、，、的万古霉素样品溶液，在制成后的 内测定每个样品溶液的，计算精密度，精密度（）标准偏差 实验值平均值 。、万古霉素样品溶液的精密度分别为 、及 ，说明样品溶液的精密度良好，符合生物样品测定要求。提取回收率的检测：取 大鼠空白血浆，加入适量对照品储备液，分别制成浓度为 、的万古霉素样品溶液，检测各样品溶液的 后，计算提取回收率，公式为 （）（指加入标准物质的样品测得量，指样品中该物质的测得量，指加入的标准物质量）。、万古霉素样品溶液的提取回收率为、，说明此方法的提取回收率良好，能满足样品溶液的测定要求。不同剂量万古霉素组大鼠血药浓度的检测：取完成心功能检测后的低剂量万古霉素组、中剂量万古霉素组、高剂量万古霉素组大鼠的血浆（离心 分离血浆），按照 的方法获取全波长扫描图，以大鼠空白血浆为对照，通过 软件计算万古霉素不同给药剂量不同时间段的 值，利用线性回归方程得到各时间段的药物浓度，以药物浓度为纵坐标，时间为横坐标，计绘制血药浓度时间曲线。统计学分析 采用 软件进行统计