1、 ：超高效液相色谱串联质谱法同时测定血清中 种脂类成分的含量宁慧，张志永，胡绪俊，彭章晓，付艳蕾，舒烈波（江苏远方检测技术服务有限公司，南京 ；上海鹿明生物科技有限公司，上海 ；东方肝胆外科医院国家肝癌科学中心，上海 ）摘要：胆固醇、磷脂和脂肪酸代谢在心血管疾病和炎癌转化的发病中起着重要作用，在生物体液样本中这条代谢通路脂质成分的理化性质和浓度水平差别很大，同时定量颇具挑战。基于此，以体积比:的甲醇二氯甲烷混合液为提取溶剂超声提取血清样本后，采用超高效液相色谱串联质谱法（）同时测定条代谢通路中 种脂类成分的含量。种脂类成分的测定可在 内完成，测定下限为 。以内标磷脂酰甘油（：）（：）、十七碳酰
2、甘油磷酰胆碱 （：）、羟基胆固醇酮、甘氨胆酸、花生四烯酸为代表研究对象，评估方法的基质效应、精密度和准确度。结果显示，基质效应因子值为 ，说明基质效应较弱。加标回收试验中目标物的回收率为 ，测定值的相对标准偏差（）均小于。方法用于测定 例健康人和 例乙型肝炎（）患者血清中 种脂类成分的含量，并将筛选后的 种差异代谢物进行热图分析和相关性分析。结果表明，与健康人血清相比，患者血清中磷脂（）和结合态的胆汁酸（）含量均是上升的，溶血磷脂（）和脂肪酸（）的含量均是下降的。与 表达呈显著正相关，与 呈显著负相关。受试者特征曲线分析（）结果显示溶血磷脂酸（：）（：）的 分析时曲线下面积（）值等于 ，具有作
3、为 诊断生物标志物的前景。关键词：超高效液相色谱串联质谱法（）；血清；脂类成分；生物标志物中图分类号：文献标志码：文章编号：（）肝脏不仅是人体内源性代谢物（氨基酸、糖类、脂类等）的重要代谢场所，还是外源性毒物的主要解毒器官。高脂、高糖、化学毒物、肝炎病毒等因素都会导致肝损伤，进而发展成为恶性肝病（肝硬化和肝癌）。年全球癌症统计报告 显示，年全球原发性肝癌新发病例为 例，死亡病例为 例，是全球第三大癌症相关死亡病因。其中，中国原发性肝癌的新发和死亡病例占全球的 ，是名副其实的肝癌大国。乙型肝炎病毒（）感染是肝癌的关键 诱因，据 统计，我 国 相 关 的 肝 癌 占 到 了 总 肝 癌 病 例 的
4、 左收稿日期：基金项目：上海市闵行区领军人才（）项目资助作者简介：宁 慧，高级工程师，从事环境毒物和内源性代谢物的色谱质谱分析通信联系人。右。大量研究表明，的感染会导致肝脏的代谢表型发生显著变化，其中，功能性脂代谢（包括胆固醇代谢、磷脂代谢和脂肪酸代谢）重塑是其重要特征。因此，定量研究 患者功能性脂代谢变化对于 的干预和治疗，以及 相关肝癌的诊断、发病机制的研究都具有重要意义。同时定量分析胆固醇胆汁酸代谢、磷脂代谢、脂肪酸代谢中关键的代谢物具有一定的挑战性，因为这些代谢物的理化性质差别比较大，而且在生物体内的浓度水平相差好几个数量级。因此，大部分定量分析工作只是聚焦于某一条代谢通路的关键代谢物
5、检测，如高效液相色谱串联质谱法用于分析人或动物模式体液中的胆汁酸或磷脂；气相色谱质谱联用法或高效液相色谱串联质谱法用于分析体液中游离脂肪酸。此外，也有少量报道利用高效液相色谱串联质谱法同时定量分析多个代宁 慧，等：超高效液相色谱串联质谱法同时测定血清中 种脂类成分的含量谢通路中的关键脂类成分 。为了建立临床大队列样品快速检测技术体系，急需解决多种类型脂类成分同时定量检测这一难点问题，为相关疾病的分子机理分析和诊断生物标志物筛选提供技术支持。本工 作 采 用 超 高 效 液 相 色 谱串 联 质 谱 法（）实现了 种重要功能性脂类成分的同时定量分析，并将该方法应用到健康人（）和 患者血清脂类成分
6、的分析中，研究 患者的脂代谢重塑和脂类成分组特征，可为 的诊断生物标志物筛选以及疾病机制的研究奠定基础。试验部分仪器与试剂 型 超 高 效 液 相 色 谱 仪；型串联质谱仪；型超声波清洗机；型涡旋振荡器；型冷冻浓缩离心干燥器。单标准储备溶液：，称取适量的标准品，用甲醇溶解并稀释，其中磷脂类化合物用三氯甲烷溶解并稀释，配制成质量浓度为的单标准储备溶液。同法制备单内标储备溶液。混合标准储备溶液：取适量的单标准储备溶液，用甲醇稀释至适当的质量浓度，制备混合标准储备溶液，其中 种磷脂（）和种溶血磷脂（）的质量浓度均为，种固醇（）和 种胆汁酸（）的质量浓度均为 ，种游离脂肪酸（）和 种氧化脂肪酸（）的质
7、量浓度均为 。同法制备混合内标储备溶液，其中，磷脂酰甘油（：）（：）的质量浓度为，十七碳酰甘油磷酰胆碱 （：）的质量浓度为 ，羟 基胆 固 醇酮 的 质 量 浓 度 为，甘氨胆酸的质量浓度为，花生四烯酸的质量浓度为 。混合标准溶液系列：取适量的混合标准储备溶液，用（体积分数，下同）甲醇溶液稀释至原来质量浓度的，配制成混合标准溶液系列。同法制备混合内标溶液系列，使用时用 甲醇溶液稀释，使内标与待测物的质量浓度一致。甲醇、乙腈、异丙醇、甲酸均为色谱纯；二氯甲烷、甲酸铵、，二叔丁基甲基苯酚（）均为分析纯；试验用水为超纯水。种待测物标准品，其中 种 、种 、种 、种 、种、种 以 及 种 内 标 （：
8、）、（：）、羟基胆固醇酮、甘氨胆酸、花生四烯酸的纯度均不小于，标准品信息详见表。个 血清样本以及 个 患者血清样本来自于东方肝胆外科医院样本库，并通过了东方肝胆外科医院伦理委员会的审查，符合伦理学规范，审批编号为 。仪器工作条件色谱条件 色 谱 柱（，）；进样体积；柱温 ；流量 ；流动相为含（体积分数，下同）甲酸、甲酸铵的体积比:的水乙腈混合液，为含甲酸、甲酸铵的体积比:的异丙醇乙腈混合液。梯度洗脱程序：时，为；时，由 升至；时，由 升至，保持 ；时，由 跳转至，保持 。质谱条件电喷雾离子（）源，正负离子（、）模式；工作站用于数据采集和分析；在时间排列的多反应监测（）模式下进行分析；气帘气压力
9、 （）和 （）；入口电压（）和（）；喷雾电压 （）和 （）；碰撞室出口电压（）和（）；雾化温度 ；雾 化 气 压 力 ；辅 助 气 压 力 。其他质谱参数见表。试验方法血液样本的前处理参考文献 中方法。取 血清，加入 混合内标溶液（：）和 （：）的质量浓度均为，羟基胆固醇酮 和 甘氨胆酸的质量浓度均为，花生四烯酸的质量浓度为 ，加入含 的体积比:的甲醇二氯甲烷混合液 ，涡旋 ，冰水浴中超声提取 ，于 静置 ，于离心（）。取上清液 ，离心浓缩干燥后，用 （体积宁 慧，等：超高效液相色谱串联质谱法同时测定血清中 种脂类成分的含量表标准品信息及质谱参数 序号代谢物 号类别离子模式保留时间 质荷比（）
10、母离子定量子离子牛磺鼠胆酸（）牛磺胆酸硫酸酯（）牛磺鼠胆酸（）牛磺猪胆酸（）脱氢胆酸（），二酮石胆酸（，）牛磺熊脱氧胆酸（）猪脱氧胆酸（）牛磺猪脱氧胆酸（）牛磺胆酸（）熊果胆酸（）甘氨猪胆酸（）甘氨鹅脱氧胆酸（）甘氨猪脱氧胆酸（），三羟基胆烷酸（，）甘氨胆酸（）鼠胆酸（）脱甲胆酸（），三羟基胆烷酸（，）牛磺鹅脱氧胆酸（）牛磺脱氧胆酸（）鼠脱氧胆酸（）熊脱氧胆酸（）猪胆酸（）熊脱氧胆酸（）别胆酸（）甘氨熊脱氧胆酸（）胆酸（）甘氨脱氧胆酸（），二酮石胆酸（，）羟基氧代胆烷酸（）酮脱氧胆酸（）牛磺石胆酸（）去甲脱氧氯酸（）鹅脱氧胆酸（）甘氨石胆酸（）脱氧胆酸（）异石胆酸（）表别石胆酸（）宁 慧，等：
11、超高效液相色谱串联质谱法同时测定血清中 种脂类成分的含量表（续）序号代谢物 号类别离子模式保留时间 质荷比（）母离子定量子离子 石胆酸（）甘氨熊胆酸（）愈伤酸（）肾上腺酸（）十一烷酸（）月桂酸（）十三酸（）二十碳五烯酸（）亚麻酸（）亚麻酸（）棕榈油酸（）二十二碳六烯酸（）花生四烯酸（）二十二酸（）亚油酸（）十五烷酸（）玛嘉油酸（）二十四酸（）棕榈酸（）反油酸（）油酸（）二十碳二烯酸（）十七烷酸（）硬脂酸（）芥酸（）神经酸（）溶血磷脂酸（：）（：）十六酰 丙三醇磷酸胆碱 （：）棕榈 甘油磷酸乙醇胺 （：）溶血磷脂酰肌醇（：）（：）油酰 甘油磷酸胆碱 （：）溶血磷脂酰丝氨酸（：）（：）硬脂酰 甘油
12、磷酰胆碱 （：）溶血磷脂酰乙醇胺（：）（：）花生酰基 甘油磷酸胆碱 （：）羟基前列腺素 （）羟基前列腺素 （）羟基前列腺素（）羟基白三烯（）酮前列腺素 （）血栓烷（）酮前列腺素 （）宁 慧，等：超高效液相色谱串联质谱法同时测定血清中 种脂类成分的含量表（续）序号代谢物 号类别离子模式保留时间 质荷比（）母离子定量子离子 前列腺素（），二氢 酮前列腺素（，）前列腺素（）异前列腺素 （）前列腺素（）前列腺素 （）前列腺素（），二氢 酮前列腺素（，），二羟化二十烷四烯酸（，）反式白三烯（）反式 表白三烯（）白三烯 （）白三烯（）白三烯（）羟基，二十碳四烯酸（，）白三烯（）（），二羟基十八 烯酸（，）
13、（，）羟基，十七碳三烯酸（）脱氧 ，前列腺素（，）羟基十八碳三烯酸（）羟基二十碳四烯酸（）（），环氧十八烯酸（，），二十碳四烯酸（）羟基二十碳四烯酸（）羟基二十二碳五烯酸（）（，），二十碳四烯酸（）羟基二十烷，四烯酸（）羟基，二十碳四烯酸（，）羟基二十烷四烯酸（）氧代庚酸酯（酮咯，丁烯酸）（），环氧二十碳三烯酸（，）磷脂酸（：）（：）磷脂酰甘油（：）（：）二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱（：），十四酰基磷脂酰乙醇胺（：），二棕榈酰基 甘油磷酸（肌醇）（铵盐）（：）宁 慧，等：超高效液相色谱串联质谱法同时测定血清中 种脂类成分的含量表（续）序号代谢物 号类别离子模式保留时间 质荷比（）母离子定量子离子 磷脂
14、丝氨酸（：）磷脂酰肌醇（：）（：）磷脂酰胆碱花生四烯酰棕榈酰（：）磷脂酰肌醇（：）（：）磷脂酰甘油（：）（：），二棕榈酰磷脂酸（：）二棕榈酸磷脂酰胆碱（：）磷脂酰胆碱（：）（：）磷脂酰丝氨酸（：）（：）油酰棕榈锡甘油磷酸胆碱（：）磷脂酰乙醇胺（：）磷脂酰肌醇（：）（：）磷脂酰胆碱（：）（：）磷脂酰甘油（：）（：）硬脂酰基油酰基 甘油磷脂酰胆碱（：），二硬酯酰 甘油磷酰乙醇胺（：）二硬脂酰磷脂酰胆碱（：），花生酰基卵磷脂（：）羟基胆固醇（）羟基胆固醇（）羟基胆固醇（）羟基胆甾烯酮（）羟基胆固醇（）羟基胆固醇（）酮基胆固醇（）胆固醇硫酸酯（）羟基胆固醇（）胆固醇（）（体积分数）甲醇溶液复溶，离心后
15、取 上清液，按照仪器工作条件进行测定。取 血清和 患者血清混合，制备适量的混合血清，离心后分装（管），作为质控（）样本，按上述条件处理并测定。结果与讨论仪器工作条件的优化试验涉及到的 种脂类成分，因其理化性质、浓度水平及丰度范围差异较大，定量分析难度较大。、和 代谢物在 模式下有更好的质谱响应，由于血清中不同类型脂肪酸链的 和 的丰度差别很大，为了能让所有的待测代谢物在线性范围内得到检测，避免高丰度的 和 代谢物的质谱响应过饱和以及低丰度的 和 代谢物低于质谱测定下限，试验中将高丰度的 和 代谢物采用 模式检测，而低丰度的 和 代谢物采用 模式检测；而 、和 代谢物在 模式下有更好的质谱响应。
16、中长链 、和 代谢物极性相对较强，在前 出峰；代谢物在 内被分离；长链 代谢物在 内出峰；代谢物极性最弱，保留最强，在 之后出峰；代谢物质谱响应相对较差，出峰时间分布在 宁 慧，等：超高效液相色谱串联质谱法同时测定血清中 种脂类成分的含量内。种脂类成分具体的仪器工作条件见节。在优化的仪器工作条件下，大部分目标代谢物的分离度和峰形均较好，在 扫描模式下目标代谢物的提取离子色谱图见图。（）下的混合标准溶液（）下的混合标准溶液（）下加内标的质控样（）下加内标的质控样图目标代谢物在扫描模式下的提取离子色谱图 提取溶剂的优化将 种脂类成分用于试验条件筛选和方法学验证的工作量是巨大的，而参考内标替代法在非常大的检测（一次性靶向检测几百个代谢物）中常被应用，试验选取了性质相似的内标作为每种类型目标代谢物的代表物。向 样本中添加 低、中、高（分别代表混合内标储备溶液质量浓度的，）的混合内标溶液，分别作为低、中、高浓度水平的质控样本，记为 、，用于提取溶剂的优化、基质效应考察和方法学验证。以质控样本 、为研究对象，以体积比:的甲醇二氯甲烷混合液和三氯甲烷作为提取溶剂，试验考察了两种提取溶剂体系对质控样中