1、 许冬梅 等/东北林蛙 adipor1 和 adipor2 基因克隆及其在感染中的表达分析 Chinese Journal of Biotechnology http:/ Apr.25,2023,39(4):1731-1746 DOI:10.13345/j.cjb.220783 2023 Chin J Biotech,All rights reserved 资助项目：黑龙江省自然科学基金(LH2021C053)This work was supported by the Natural Science Foundation of Heilongjiang Province(LH2021C053
2、).*Corresponding authors.E-mail:LIU Yufen,;ZHAO Wenge, Received:2022-09-28;Accepted:2022-12-31;Published online:2023-01-17 1731 生物工程学报 东北林蛙 adipor1 和 adipor2 基因克隆及其在感染中的表达分析 许冬梅，刘依铭，孙玉刚，刘玉芬*，刘鹏，赵文阁*哈尔滨师范大学生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150025 许冬梅,刘依铭,孙玉刚,刘玉芬,刘鹏,赵文阁.东北林蛙 adipor1 和 adipor2 基因克隆及其在感染中的表达分析J.生物工程学报,
3、2023,39(4):1731-1746.XU Dongmei,LIU Yiming,SUN Yugang,LIU Yufen,LIU Peng,ZHAO Wenge.Cloning of adipor1 and adipor2 genes in Rana dybowskii and its expression pattern upon infectionJ.Chinese Journal of Biotechnology,2023,39(4):1731-1746.摘 要：脂联素受体 1(adiponectin receptor 1,AdipoR1)和脂联素受体 2(adiponectin
4、receptor 2,AdipoR2)能够与脂肪组织分泌的脂联素(adiponectin,AdipoQ)相结合，参与机体的多种生理功能。为探究 AdipoR1 和 AdipoR2 在嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)感染下两栖类炎症反应中的作用，通过逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)技术克隆东北林蛙(Rana dybowskii)的 adipor1 和 adipor2 基因，对 adipor1 和 adipor2 进行生物信息学分析；利用实时荧光定量聚合酶链式反应(r
5、eal-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)技术分析 adipor1 和 adipor2 的组织表达差异，构建 Ah 感染的东北林蛙炎症模型，通过苏木精-伊红染色法(hematoxylin-eosin staining,HE)观察组织病理变化；再利用 qRT-PCR 和 Western blotting 对感染后不同时间点的 adipor1 和 adipor2 的表达进行动态检测。结果表明，AdipoR1 和AdipoR2 均为具有 7 次跨膜结构域的膜蛋白；系统进化树也显示与两栖类聚为同一分支；基于
6、qRT-PCR 和 Western blotting 结果显示，Ah 感染下 adipor1 和 adipor2 在转录和翻译水平发生不同程度的上调表达，但应答时间和水平有所差异。综上所述，推测 AdipoR1和 AdipoR2参与了机体的细菌免疫应答过程，为进一步探究脂联素受体在两栖类的生物学功能提供参考。关键词：东北林蛙；嗜水气单胞菌；adipor1 基因；adipor2 基因；细菌感染 动物及兽医生物技术 ISSN 1000-3061 CN 11-1998/Q 生物工程学报 Chin J Biotech http:/ 1732 Cloning of adipor1 and adipor2
7、 genes in Rana dybowskii and its expression pattern upon infection XU Dongmei,LIU Yiming,SUN Yugang,LIU Yufen*,LIU Peng,ZHAO Wenge*College of Life Science and Technology,Harbin Normal University,Harbin 150025,Heilongjiang,China Abstract:Adiponectin receptor 1(AdipoR1)and Adiponectin receptor 2(Adipo
8、R2)can bind to adiponectin(AdipoQ)secreted by adipose tissue to participate in various physiological functions of the body.In order to explore the role of AdipoR1 and AdipoR2 in amphibians infected by Aeromonas hydrophila(Ah),the genes adipor1 and adipor2 of Rana dybowskii were cloned by reverse tra
9、nscription-polymerase chain reaction(RT-PCR)and analyzed by bioinformatics.The tissue expression difference of adipor1 and adipor2 was analyzed by real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction(qRT-PCR),and an inflammatory model of R.dybowskii infected by Ah was constructed.The histop
10、athological changes were observed by hematoxylin-eosin staining(HE staining);the expression profiles of adipor1 and adipor2 after infection were dynamically detected by qRT-PCR and Western blotting.The results show that AdipoR1 and AdipoR2 are cell membrane proteins with seven transmembrane domains.
11、Phylogenetic tree also shows that AdipoR1 and AdipoR2 cluster with the amphibians in the same branch.qRT-PCR and Western blotting results show that adipor1 and adipor2 were up-regulated at different levels of transcription and translation upon Ah infection,but the response time and level were differ
12、ent.It is speculated that AdipoR1 and AdipoR2 participate in the process of bacterial immune response,providing a basis for further exploring the biological functions of AdipoR1 and AdipoR2 in amphibians.Keywords:Rana dybowskii;Aeromonas hydrophila;adipor1 gene;adipor2 gene;bacterial infection 脂联素(a
13、diponectin,AdipoQ)是一种由脂肪组织分泌的具有调节能量平衡1、抗动脉粥样硬化2、参与脂质代谢3、繁殖4以及免疫功能5的 细 胞 因 子。AdipoQ 通 过 与 脂 联 素 受 体(adiponectin receptor,AdipoR)结合介导生物学功能，其中 AdipoR 主要包括 AdipoR1、AdipoR2和功能性受体 T-钙黏蛋白(T-cadherin,T-cad)。2003 年 Yamauchi 等6首次在人体发现 AdipoR1和 AdipoR2，其中 AdipoR1 对球状脂联素具高度亲和性，而对全长脂联素亲和力低；AdipoR2对球状和全长脂联素都具有中度亲
14、和力。以往研究6证实 AdipoR1和AdipoR2是具有7次跨膜结构域的细胞膜蛋白质，二者拓扑结构与 G 蛋白偶联受体相反，其氨基端在细胞内，羧基端在细胞外。T-钙黏蛋白是近年来新发现是一种 Ca2+依赖的糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol,GPI)锚定蛋白，锚定在细胞表面，对全长脂联素形成的多聚合体具有结合功能7。AdipoQ 与AdipoR1、AdipoR2 和 T-cad 结合后，能够靶向定位多种免疫细胞，参与先天性免疫和获得性免疫。AdipoR1 主要激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)和
15、p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase,p38 MAPK)通路；而 AdipoR2 主要通过环 许冬梅 等/东北林蛙 adipor1 和 adipor2 基因克隆及其在感染中的表达分析 ：010-64807509： 1733 氧化物酶 2(cyclooxygenase-2,COX-2)和过氧化物 酶 体 增 殖 物 活 化 受 体/(peroxisome proliferator-activated receptor/,PPAR/)通路发挥生物学功能的多效性8-9。近年来，adipor1和adipor2基因已经在人3、鼠10、鱼类1
16、1和鸟类12中得到鉴定，发现二者在哺乳动物代谢旺盛的组织中广泛分布，例如adipor1 在骨骼肌中大量表达，而 adipor2 在肝脏中大量表达。研究证明由于 AdipoR1 和AdipoR2 在多种免疫细胞膜上表达，如嗜酸性粒细胞13、肥大细胞14和巨噬细胞15，导致AdipoQ 与其受体结合后，一方面刺激免疫细胞的增殖，另一方面 AdipoR1 可以介导巨噬细胞中 核 转 录 因 子(nuclear factor-gene binding,NF-B)信号通路的激活和促炎细胞因子的表达，AdipoR2 通过介导抗炎 M2 巨噬细胞极化参与炎症反应16-17。AdipoR1 和 AdipoR2 也能够参与自身免疫病如类风湿性关节炎中，炎症促进AdipoQ、AdipoR1 和 AdipoR2 的表达，发挥抗炎作用的同时促进其他促炎介质的表达18-19。研究发现，在人类的 AdipoQ-AdipoR1 轴通过促进调节性T细胞释放白细胞介素-10(interleukin-10,IL-10)，对炎症反应进行响应20。上述研究表明AdipoR1 和 AdipoR2 能够参与炎症反应过程，而两栖类