1、栏目编辑 魏友海饲料与营养2023.4动，这可能刺激幼鱼进行捕食，从而使幼鱼摄入更多的饵料。而冰鲜丰年虫随着放入冰箱时间的延长，部分营养物质可能发生改变，从而不能很好地为月鳢幼鱼提供所需营养。三、小结使用鲜活丰年虫和冰鲜丰年虫作为月鳢开口饵料，对于月鳢幼鱼的成活率无较大影响。冰鲜饵料可节省人力等成本，而鲜活饵料更有利于幼鱼的生长，养殖户在生产过程中可根据实际需要进行选择。需要注意的是如果选择鲜活丰年虫作为开口饵料，要完全去除丰年虫的壳及未孵化的丰年虫卵；如果选择冰鲜丰年虫作为开口饵料，需要使丰年虫饵料的温度与养殖用水的温度保持一致后再进行投喂。江苏常州市金坛区、兴化市及建湖县等地在河蟹养殖中，
2、常利用池塘中的丰富水草给蟹提供良好的栖息环境；并将小龙虾与河蟹混养，以充分利用水资源和土地资源，增加农户的经济收入(曹凑贵等，2017)。在虾蟹共作池塘中泼洒微生物复合菌剂是净化水质、提高水产动物免疫力的常见操作(王红强等，2014)。但是近年来在大量施用生物菌剂如多菌发酵剂的虾蟹养殖塘中依然暴发了以弗氏柠檬酸杆菌、嗜水气单胞菌等为致病菌的虾蟹烂鳃、烂眼病症(Liu X等，2020)。因此产业中需要找到一种既可以达到调节水质功效、又对几种流行性致病菌有较好抑制作用的微生态制剂，其中短小芽孢杆菌被认为是具备这种潜力的菌种之一(郭婧等，2013)。短小芽孢杆菌是一种革兰氏阳性土壤细菌，被认为是生产
3、化学品、异源蛋白质和抗菌材料的潜在宿主菌株，常在农业上被添加在微生物肥料中，可以有效防止作物的根腐病，使农作物减少发病率。研究显示短小芽孢杆菌在养殖水体中具有抑藻、抗菌等重要作用(胡明明等，2012；王静等，2018)，具有很好的应用前景。因此，本文分析短小芽孢杆菌的施用对虾蟹养殖塘口的水质、常见致病细菌和水体叶绿素a以及微囊藻毒素(MC-LR)的影响，旨在为虾蟹养殖的健康发展及新型微生态制剂的开发提供一定的理论依据和帮助。一、实验设计及方法1.实验设计实验采用的短小芽孢杆菌培养液为实验室从家蝇养殖环境分离、鉴定后培养的菌种，菌液培养至活菌数达(2.03.0)108个/克，低温保存待用。多菌发
4、酵剂有效活菌数2.0108个/克，主要菌种为光合细菌、酵母菌、放线菌及木霉菌。侯颖1，冯东波2，廖正军3，曹帆4，刘胜利4，安振华1(1.扬州大学动物与科学技术学院，江苏 扬州225009；2.常州市万叶饲料科技有限公司，江苏 常州213000；3.江苏军曼农业科技有限公司，江苏 盐城224700；4.扬州正泰永环保科技有限公司，江苏扬州225009)基金项目：常州市重点研发计划(2021-40)；江苏省苏北科技专项(SZ-YC202036)；扬大教研项目(2020-D26)通信作者：安振华74DOI:10.14184/ki.issn1004-843x.2023.04.036栏目编辑 魏友海2
5、023.4饲料与营养实验地点位于扬州市邗江区槐泗镇大王庄，将 6 个 1.5 亩左右的虾蟹养殖塘分为两组，在2020年4月中旬分别以2.5千克/亩泼洒多菌发酵剂和短小芽孢杆菌菌液，另备3个养殖塘口作为对照。菌液施用24、48和72小时后对水体进行水质分析，分析指标包括pH、氨氮和亚硝酸盐。pH采用pH仪测定，氨氮参照水质 铵的测定(GB/T74791987)测定，亚硝酸盐含量采用 N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定，以研究多菌发酵剂和短小芽孢杆菌施用对虾蟹养殖塘口水质的影响，同时通过平皿计数法测定1毫升水样中的菌落总数(在120小时中随时间变化)。前期实验结束后利用牛津杯法测定短小芽孢杆菌
6、滤液(0.2微米微孔滤膜抽滤)对5种细菌(蜂房哈夫尼亚菌、嗜水气单胞菌、假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌和寡养单胞菌)的抑菌能力。牛津杯中短小芽孢杆菌滤液加入量为100微升，加满后培养基正面向上于37条件下培养1618小时，观察结果并测量抑菌圈大小。4月30日分别在6个处理塘口和空白塘口中取表层20厘米处水样，取样时间为上午11:00，用以测定水体叶绿素a浓度和MC-LR浓度。分析MC-LR含量和叶绿素a浓度相关规律及短小芽孢杆菌和多菌发酵剂对水体叶绿素a和MC-LR的影响。叶绿素a测定采用90%丙酮为提取试剂，玻璃纤维滤膜过滤水样(抽滤前加入碳酸镁)，研磨后4浸泡提取浮游植物的叶绿素，采用分光光度法
7、测定 664、647、630、750纳米吸光度，利用三色公式计算叶绿素a含量，剩余水样经玻璃纤维滤膜过滤后，通过MC-LR测定酶联免疫吸附试剂盒(北京金强环境科技公司)于酶标仪中(I-MarkTM 168-1130的)测定毒素浓度。2.数据统计与分析实验数据统计采用Excel 2013和Spss 10进行分析。利用单因子方差分析(one-way ANOVA)和Duncan多重检验比较分析不同处理的差异，以P0.05认定为差异达到显著水平。二、实验结果1.短小芽孢杆菌对水体环境因子的影响短小芽孢杆菌和多菌发酵剂施用对水体 pH、氨氮、亚硝酸盐含量的影响如表1所示。结果表明多菌发酵剂和短小芽孢杆菌
8、均可以迅速降低池水pH，并在48小时和72小时显著降低池水的氨氮和亚硝酸盐含量，与对照相比均达到差异显著水平(P0.05)，短小芽孢杆菌的施用效果总体略好于多菌发酵剂。表1短小芽孢杆菌和多菌发酵剂对水体pH、氨氮、亚硝酸盐的影响2.短小芽孢杆菌对5种致病菌的抑菌效果实验研究了短小芽孢杆菌滤液对弗氏柠檬酸杆菌、蜂房哈夫尼亚菌、嗜水气单胞菌等细菌的抑菌效果，结果表明短小芽孢杆菌滤液对这些细菌均有一定的抑菌效果(表2)，其中对实验室从病蟹烂眼症中分离测定的一株弗氏柠檬酸杆菌呈极敏，对蜂房哈夫尼亚菌、假单胞菌和寡养单胞菌呈高敏。表2短小芽孢杆菌对5种细菌的抑菌效果注：抑菌圈直径()20毫米为极敏，15
9、毫米20毫米为高敏，10毫米15毫米为中敏，5毫米10毫米为低敏，5毫米为不敏3.短小芽孢杆菌对水体总菌数的影响与空白对照组相比，短小芽孢杆菌生物制剂的添加大幅提高了水体的总菌落数；随着时间变化，处理组总菌落数虽然有所回落，但在120小时内依然保持了稳定。4.短小芽孢杆菌对水体叶绿素a含量和微囊藻毒素的影响实验结果显示短小芽孢杆菌处理组的水体叶绿素a和MC-LR含量均显著低于多菌发酵剂和对照组；多菌发酵剂处理组的叶绿素a和MC-LR含量均显著高于其他两组(P0.05)。实验结果还显示水体中 MC-LR 含量与叶绿素 a 含量明显相关。Y项目pH氨氮(毫克/升)亚硝酸盐(毫克/升)24小时48小
10、时72小时24小时48小时72小时24小时48小时72小时多菌发酵剂7.40.67.60.27.50.30.0450.0120.0310.0050.0240.0070.0120.0040.0060.0010.0010.000短小芽孢杆菌7.60.48.10.38.20.30.0470.0140.0270.0040.0210.0070.0130.0020.0040.0010.0020.000对照组8.10.38.30.88.71.20.0410.0170.0450.0110.0420.0150.0100.0040.0090.0030.0080.002细菌种类XLX-2(蜂房哈夫尼亚菌)XLX-4
11、(嗜水气单胞菌)XLX-11(假单胞菌)XLX-16(弗氏柠檬酸杆菌)XLX-17(寡养单胞菌)短小芽孢杆菌抑菌圈直径(毫米)15.52.012.82.115.31.123.52.515.12.075栏目编辑 魏友海饲料与营养2023.41.618X8.526，R20.928，其中Y为叶绿素a含量，X为MC-LR含量(单位：微克/升)。三、讨论1.短小芽孢杆菌对水质的影响大量研究表明，施用微生物菌剂对养殖池中水体具有净化和改良作用，有稳定 pH(方云东，2004)、降低氨氮和亚硝酸盐含量等效果(左明等，2014)。本实验研究结果显示，施用短小芽孢杆菌、多菌发酵剂24小时后，水体的pH均迅速降低
12、，但施用多菌发酵剂会使水体pH的降低幅度更大。据王笃彩等(2011)研究发现，使用微生态制剂处理河蟹养殖水体能有效降低水体中氨氮和亚硝酸盐含量；康银等(2015)在草鱼养殖池中施用EM 复合菌剂调节水质，也得到了相同的实验结论。本实验表明，单独施用多菌发酵剂和短小芽孢杆菌均可以降低水体中氨氮和亚硝酸盐含量，且施用4872小时的结果与对照组相比达到差异显著水平(P0.05)，其中短小芽孢杆菌的施用效果总体略好于多菌发酵剂，说明短小芽孢杆菌具备了同多菌发酵剂相近似的塘口水质净化处理能力。2.短小芽孢杆菌对常见致病菌的抑菌研究近年来，虾蟹共作养殖模式高速发展，规模持续扩大，养殖密度也随之逐步提高，尤
13、其在养殖后期，水质急剧恶化，大量病原菌滋生造成小龙虾在养殖过程中大量损伤，其中最常见的当属细菌性疾病。细菌性疾病一旦发生，会迅速引起其他并发症，造成河蟹、小龙虾大量伤亡，给养殖户造成很大经济损失(祖国掌等，2007；李华等，2001)；致病菌主要有嗜水气单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌、粪产碱杆菌、少动假单胞菌、产碱假单胞菌和苏云金芽孢杆菌等。本实验结果表明在实验条件相同的情况下，短小芽孢杆菌对弗氏柠檬酸杆菌、蜂房哈夫尼亚菌、假单胞菌、寡养单胞菌的抑制效果较好，其抑菌圈直径均达到15毫米以上。其中短小芽孢杆菌对从虾蟹烂眼症中分离的菌株XLX-16抑菌效果最好，从而为短小芽孢杆菌控制弗式柠檬酸杆菌引起的虾
14、蟹烂眼症提供了理论佐证。另有研究显示短小芽孢杆菌对于水产养殖中常见的副溶血弧菌、溶藻弧菌等致病菌也有很好的抑制作用(韦露等，2015)，并且可以与枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌共同包裹在对虾饲料表面，制成益生菌饲料，投喂该饲料可以大幅度提高凡纳滨对虾的抗白斑综合征病毒(WSSV)能力(孙博超等，2019)。以上研究都表明基于短小芽孢杆菌开发的生物菌剂在生态防病方面有很好的开发前景。3.短小芽孢杆菌对水体总菌数的影响虾蟹养殖后期水体中常含有大量的致病微生物，水体菌落总数往往很高。本次实验显示在施用24小时后短小芽孢杆菌组的总菌落数明显高于对照组，说明短小芽孢杆菌组对实验环境水体适应能力较强，使得初期
15、水体总菌落的数量小幅增长。经过96120小时，短小芽孢杆菌组和对照组相比仍然保持了较高的菌落总数，可以推测短小芽孢杆菌在水体中相对稳定。有研究显示芽孢杆菌抑菌主要是依靠其分泌的胞外物质(张新明，2004)，稳定的菌群数量可以保证短小芽孢杆菌持续发挥其抑菌功效。4.短小芽孢杆菌对水体叶绿素 a 和 MC-LR 的影响在我国大部分的虾蟹养殖水域，春夏季水温上升期间会有部分蓝藻水华出现，其中50%70%的 水 体 中 会 产 生 一 定 量 的 微 囊 藻 毒 素(WHO，2006)。微囊藻毒素性质稳定，在虾蟹养殖环节普遍存在且较难以消除，严重影响水产品食用安全性，其中MC-LR是目前已知的毒性最强
16、、危害最严重的一种蓝藻毒素(谢平，2006)。MC-LR胁迫不仅影响了鱼虾等水生生物的存活，同时MC-LR会在其体内蓄积，影响正常生理活动(Li X Y等，2003；An Z H等，2015)。与本研究结果相近的研究显示多菌发酵剂的使用会使水体出现一定的藻类增长(陈书秀等，2016)，在露天池塘使用也很容易引起藻毒素含量增加。短小芽孢杆菌可以在一定程度上抑制池塘中藻类生长，并降低池塘水体中MC-LR含量。在淡水虾蟹养殖中因养殖水体浅、温度上升快，藻类繁殖速度快，所以要完全清除微囊藻毒素较困难，可以尽可能地降低养殖水体中藻毒素的残留、提高虾蟹食用安全性。因此，开发基于短小芽孢杆菌为核心成分的微生物菌剂有很高的价值。76