1、 实 验 技 术 与 管 理 第 40 卷 第 4 期 2023 年 4 月 Experimental Technology and Management Vol.40 No.4 Apr.2023 收稿日期:2022-10-24 基金项目:四川省科技厅重点研发计划（2023YFQ0001）；四川省科技厅省院省校科技合作重点项目（2021YFSY0041）；西南交通大学 2022年校级实验教学研究与改革项目（20221460）作者简介:任瑶瑶（1982），女，河北石家庄，硕士，工程师，主要研究方向为中药资源鉴定，。引文格式:任瑶瑶，郑颖，柯家伟，等.ITS2 序列作为 DNA 条形码鉴定几种虎耳
2、草科植物的有效性研究J.实验技术与管理,2023,40(4):20-24.Cite this article:REN Y Y,ZHENG Y,KE J W,et al.Validation studies of ITS2 sequence as DNA barcode to identify several SaxifragaceaeJ.Experimental Technology and Management,2023,40(4):20-24.(in Chinese)ISSN 1002-4956 CN11-2034/T DOI:10.16791/ki.sjg.2023.04.002 实验技
3、术与方法 ITS2 序列作为 DNA 条形码鉴定几种虎耳 草科植物的有效性研究 任瑶瑶1，郑 颖2，柯家伟2，姚雨庭2，谢 浈2，蒋合众2（1.西南交通大学 化学学院，四川 成都 610031；2.西南交通大学 生命科学与工程学院，四川 成都 610031）摘 要：利用 DNA 条形码分子诊断技术对几种虎耳草科药用植物进行鉴定并评价 ITS2 序列对虎耳草科植物鉴定的有效性，为虎耳草科植物鉴定提供一种新思路。于不同区域采集 13 份虎耳草科植物样本，提取基因组 DNA 后，利用 ITS2 序列扩增引物进行 PCR 扩增及测序，并从 GenBank 数据库中下载 11 条同属及同科序列。基于 H
4、HMer注释方法去掉两端区段获得 ITS2 序列，采用 MEGA7.0 软件进行序列长度、碱基含量对比，并基于 K2P 模型计算并分析种内、种间遗传距离，采用邻接法构建 NJ 系统进化树，采用靴带检验法（1 000 次重复）检验各分支的支持率，于 ITS2 数据库网站预测并比较 ITS2 序列的二级结构。结果显示，虎耳草科植物种间遗传距离大于种内遗传距离，能将各物种区分；系统进化树中各属分别聚为一支，同属内各物种大多分别聚为一小支，部分物种的鉴定需要进一步研究；各物种 ITS2 二级结构均存在不同差异，可对物种鉴定进行辅助分析。利用 ITS2 序列作为DNA 条形码可有效地区分鉴别几种虎耳草科
5、药用植物。关键词：虎耳草科；DNA 条形码；ITS2 序列；分子鉴定；遗传距离 中图分类号：R282.5 文献标识码：A 文章编号：1002-4956(2023)04-0020-05 Validation studies of ITS2 sequence as DNA barcode to identify several Saxifragaceae REN Yaoyao1,ZHENG Ying2,KE Jiawei2,YAO Yuting2,XIE Zhen2,JIANG Hezhong2(1.College of Chemistry,Southwest Jiaotong Universit
6、y,Chengdu 610031,China;2.School of Life Science and Engineering,Southwest Jiaotong University,Chengdu 610031,China)Abstract:Using DNA barcode molecular diagnostic technology to identify the medicinal plants of Saxifragaceae area and evaluate the effectiveness of ITS2 sequences in the identification,
7、which providing a new idea for identifying plants of Saxifragaceae.Collecting 13 plant samples of Saxifragaceae in different areas to extract genomic DNA,PCR amplify and sequencing using ITS2 sequence amplification primers,then downloading 11 sequences of the same genus and family from the GenBank d
8、atabase.Removing the sequence at both ends to obtain the ITS2 sequences based on the HHMer annotation method,then using MEGA7.0 software to compare the sequence length and base content,and calculate and analyze the inter-and intra-specific genetic distance based on the K2P model.Constructing NJ phyl
9、ogenetic tree using neighbor-joining way,checking the support rate of each branch using bootstrap inspection method(1 000 repetitions).Predicting and comparing the secondary structures of the ITS2 sequences on the ITS2 database website.The results show that the intra-specific genetic distance is hig
10、her 任瑶瑶，等：ITS2 序列作为 DNA 条形码鉴定几种虎耳草科植物的有效性研究 21 than the inter-specific genetic distance of Saxifragaceae,which can distinguish each species.Each genus is gathered into a branch in the phylogenetic tree,and most species in the same genus are gathered into a small branch,the identification of some spe
11、cies requires further study.The secondary structures of ITS2 sequences of each species are different,which can assist in the analysis of species identification.Using the ITS2 sequences as DNA barcode can identify the plants of several Saxifragaceae effectively.Key words:Saxifragaceae;DNA barcode;ITS
12、2 sequence;molecular identification;genetic distance DNA 条形码技术为利用一段或几段公认的标准DNA 短序列对物种进行鉴定的新兴分子诊断技术，其不受植物生长环境、物种形态及发育阶段的限制，具有准确、快速、自动化的优点1-2，广泛应用于物种鉴定3。ITS2 序列为 ITS 序列中的一段，在物种间变异明显，还具有进化速率快、通用性好等优点4-5。自陈士林等6提出将 ITS2 序列作为鉴定药用植物的标准DNA 条形码以来，其被广泛应用于多种物种和药材的鉴定，成为中药鉴定不可缺少的技术。本文以虎耳草科植物（Saxifragaceae）为例，以 I
13、TS2 序列作为 DNA条形码鉴定对几种虎耳草科植物进行研究，该实验项目可运用在中药鉴定方面的教学中。虎耳草科植物种类丰富多样，约有 17 亚科 80 属1 200 余种7，研究表明大部分具有药用价值8。虎耳草科植物丰富，其中：虎耳草属（Saxifraga）具有清热解毒9、止咳消痞10、治疗皮肤湿疹11等作用；茶藨子属（Ribes）具有降血脂、软化血管9、消炎止痛12、抗肿瘤13等作用；落新妇属（Astilbe）具有镇咳祛痰14、抗真菌15、抗高尿酸血症16等作用；岩白菜属（Bergenia）具有止咳抗菌17、止血18、平喘消炎19等作用。中药材存在品种混乱、基源复杂、资源滥用等问题20，DN
14、A 条形码技术对分类鉴定工作具有重要意义。本研究在采集虎耳草科植物样品后，于实验室提取 DNA、采用 PCR 方法获得 ITS2 序列，在 GenBank数据库中下载同科植物序列，对所有序列进行碱基含量、遗传距离分析并构建 NJ 系统进化树、预测比较二级结构，将 DNA 条形码研究与 ITS2 二级结构相结合，建立能够有效鉴定该科植物的分子层面方法，形成虎耳草科药用植物分子鉴定体系，保证临床用药的安全，为虎耳草科药用植物的资源保护、合理开发利用奠定基础，促进虎耳草科药材市场的可持续发展。1 材料及试剂 1.1 样品采集 13 份虎耳草科植物样品采自四川省泸定县、西藏林芝市，由西南交通大学生命科
15、学与工程学院宋良科副教授进行鉴定，按照形态学特征分类鉴定为绣球、莼兰绣球、细枝茶藨子、宝兴茶藨子、球茎虎耳草、山地虎耳草、异叶虎耳草、小伞虎耳草、落新妇、大落新妇和岩白菜，样本属名、名称、采集地点见表 1，标本经鉴定后用硅胶干燥保存于西南交通大学生命科学与工程学院标本室。同时在 GenBank 数据库中下载虎耳草科植物 ITS2 序列 11 条，信息见表 2。表 1 虎耳草科植物样本信息 属名 植物名称 拉丁名 序列长度/bpGC 含量/%采集地点 GenBank 登录号 绣球属 绣球 Hydrangea macrophylla 231 58.0 四川省泸定县 MT431420 绣球属 莼兰绣
16、球 H.longipes 231 66.2 四川省泸定县 MT363613 茶藨子属 细枝茶藨子 Ribes tenue 238 56.3 四川省泸定县 MT363615 茶藨子属 细枝茶藨子 R.tenue 238 56.7 四川省泸定县 MT431421 茶藨子属 宝兴茶藨子 R.moupinense 238 56.7 四川省泸定县 MT363616 虎耳草属 球茎虎耳草 Saxifraga sibirica 238 63.5 四川省泸定县 MT363611 虎耳草属 山地虎耳草 S.sinomontana 239 55.7 四川省泸定县 MT363612 虎耳草属 异叶虎耳草 S.diversifolia 239 56.9 四川省泸定县 MT363614 虎耳草属 小伞虎耳草 S.umbellulata 239 56.1 西藏自治区林芝市 MT460411 落新妇属 落新妇 Astilbe chinensis 245 63.6 四川省泸定县 MT431422 落新妇属 落新妇 A.chinensis 251 60.2 四川省泸定县 MT431423 落新妇属 大落新妇 A.gra