1、ICS11.220CCS B 41NY中华人民共和国衣业行业标准NY/T554-2023代替NYT554一2002鸭甲型病毒性肝炎1型和3型诊断技术Diagnostic techniques for duck A viral hepatitis 1 and 32023-02-17发布2023-06-01实施中华人民共和国农业农村部发布NY/T554-2023鸭甲型病毒性肝炎1型和3型诊断技术1范围本文件规定了鸭甲肝病毒1型和3型在鸭胚中的分离、RT-PCR鉴定、RT-qPCR鉴定；鸭甲肝病毒1型的微量中和试验鉴定、抗体的微量中和试验检测和胚胎中和试验方法：鸭甲肝病毒3抗体的胚胎中和试验方法。本
2、文件适用于鸭甲型病毒性肝炎型和3型的诊断与检疫2规范性引用文件本文件没有规范性引用文件3术语和定义本文件没有需要界定的STANDARD定义4缩略语下列缩略语适用下本DHAV:鸭中肝病麦Duck Hepatius A VitusDEF:鸭胚成纤维细胞(Duck Embryo Fibroblasts)DEL:鸭胚肝细胞Duck Embryo Liver Cel1s)DEEC:鸭胚上皮细胞SLISHING ESEARCHDuck Embryo Epithelial Cells)CPE:细胞病变CytoDMEM:杜氏改良伊培养基Dulbeccos Modified色agle MeTCID:o:半数细胞
3、培养感染量Median Fissue Culture Infective D6W/V:重量体积比(Weight/Volume)ENRT-PCR:反转录来酶锅erse lranscription-Polymerase ChainPBS:磷酸盐缓冲液RT-qPCR:荧光定量PC在quantitave reartime PCR5临床诊断5.1临床症状5.1.1该病主要发生于3周龄以内的维鸭，并日以1周龄内的雏鸭为主。感染鸭发病急、传播快、病死率高。5.1.2发病初期，病鸭精神萎靡，食欲减退或废绝，眼半闭呈昏睡状，头触地；12h24h后，病鸭出现神经症状，表现为运动失调、身体倒向一侧、两脚痉挛，死前头
4、向背部扭曲，两腿伸直、向后张开，呈典型的角弓反张状。5.1.3最急性病鸭常未见任何异常而突然抽搐痉挛死亡。5.2病理变化5.2.1大体病变主要为肝脏肿大、质地易脆，表面呈黄红色或花斑状，并有特征性的点状出血或刷状出血。5.2.2多数病例可见胆囊肿胀、胆汁充盈，部分病例脾脏肿大。5.2.3急性病例的组织学病变表现为肝细胞坏死、变性和淋巴细胞浸润，慢性病例或耐过鸭常见不同程NY/T554-2023度的空泡变性和淋巴细胞聚集。5.3结果判定凡具有5.1临床症状和5.2病理变化的病鸭，初步判定为疑似鸭病毒性肝炎。6病毒分离6.1仪器设备6.1.1冷冻台式离心机。6.1.2照蛋器。6.1.3恒温培养箱。
5、6.1.41mL注射器及针头。6.1.5手术剪。6.1.6镊子。6.1.7研体。6.2耗材0.22m细菌滤器。6.3试剂6.3.1青霉素。6.3.2链霉素。6.3.3卡那霉素。6.3.4PBS溶液，按照附录A的规定配制。6.3.550%甘油生理盐水。6.4胚胎10日龄12日龄DHAV-1或DHAV-3抗体阴性鸭胚。6.5样品采集6.5.1采集感染初期或发病急性期病鸭的肝脏。6.5.2送检病料置于灭菌的50%甘油生理盐水中。6.6样品保存6.6.1采集的样品若在48h内处理，可于4保存。6.6.2或尽快置于一20以下保存(-70储存最好)。6.7样品处理6.7.1组织样品于研钵中研磨后加人5倍1
6、0倍pH7.27.4的PBS溶液，制成组织悬浮液。然后3000r/min4离心30min,取上清液作为接种材料。6.7.2为防止细菌污染，可在样品液中加入青霉素1000IU/mL、链霉素1000g/mL和卡那霉素1000g/mL,于37温箱中作用30min。或采用0.22m细菌滤器对上述病料样品液作滤过除菌。6.7.3对处理的样品作无菌检验。6.8鸭胚接种6.8.1取已处理并且无菌检验合格的样品，经尿囊腔接种10日龄12日龄的非免疫鸭胚，每枚鸭胚接种0.2mL病毒液，每个样品接种4枚5枚鸭胚。将已接种病毒的鸭胚置于37恒温培养箱中孵育。6.8.2弃去接种后24h内死亡的鸭胚。对24h内未死亡的鸭胚，每间隔6h观察胚胎的死亡情况。收集24h96h死亡鸭胚，放人4冰箱中静置4h12h,待鸭胚血管收缩，进行鸭胚剖检。6.9胚胎病变胚胎大体病变为发育迟滞、全身皮下出血、腹部和后肢水肿。胚肝呈黄红色、肿胀，并可能有坏死灶。2