1、ICS 11.220CCS B 41NY中华人民共和国农业行业标准NY/T540-2023代替NYT5402002鸡病毒性关节炎诊断技术Diagnostic techniques for avian viral arthritis2023-02-17发布2023-06-01实施中华人民共和国农业农村部发布NY/T540-2023前言本文件按照GB/T1.1一2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件代替NY/T540一2002鸡病毒性关节炎琼脂凝胶免疫扩散试验方法，与NY/T540一2002相比，除结构调整和编辑性改动外，主要技术变化如下：a)增加了引言；b)
2、增加了规范性引用文件（见第2章）：c)增加了术语和定义（见第3章）：d)增加了缩略语（见第4章）；e)增加了临床诊断（见第5章）；)增加了样品采集和处理（见第6章）；g)删除了琼脂凝胶免疫扩散试验（见2002年版的第2章）；h)增加了病毒分离与鉴定（见第7章）；i)增加了RT-PCR试验（见第8章）：j)增加了实时荧光RT-PCR试验（见第9章）；k)增加了间接ELISA(见第10章)；1)增加了综合判断（见第11章）。请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。本文件由全国动物卫生标准化技术委员会(SAC/TC181)归口。本文
3、件起草单位：中国动物卫生与流行病学中心、山东农业大学、青岛易邦生物工程有限公司。本文件主要起草人：李阳、于晓慧、唐熠、刘东、刘朔、左媛媛、蒋文明、李金平、张富友、苏红、王楷成、王素春、王一新、王静静、侯广宇、刁有祥、刘华雷。本文件及其所代替文件的历次版本发布情况为：一2002年首次发布为NY/T540一2002；一本次为第一次修订。INY/T540-2023引言鸡病毒性关节炎，又称病毒性腱鞘炎或滑液囊炎，是由不同血清型及致病型的禽呼肠孤病毒(AvianReovirus,ARV)感染引起的鸡或火鸡的一种传染病。该病传播速度快、发病范围广，不同日龄、不同品种的鸡均可感染，但对商品肉鸡的危害尤为严重
4、，给我国肉鸡养殖业造成严重经济损失。农业农村部将本病列为三类动物疫病。该病一年四季均可流行，以冬季多发，呈散发或地方性流行。病鸡和带毒禽是主要的传染源，可通过消化道和呼吸道传播。同时，病鸡在鸡群中既能水平传播，也能经蛋垂直传播。临床上多见于4周龄16周龄的鸡，尤以4周龄7周龄多发，以跛行、关节炎、腱鞘炎、腓肠肌肌腱断裂为主要特征。禽呼肠孤病毒在分类地位上属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属，病毒粒子呈二十面体对称排列，有双层衣壳结构，无囊膜，直径约75nm,一般无血凝特性。病毒的基因组为分节段的双股RNA,由大小不同的3个类别的10个节段组成。鸡病毒性关节炎目前仍是严重威胁养禽业健康发展的重要疫病，
5、近年来呈现新的流行特点，流行毒株也不断变异，存在多种血清型和基因型的病毒同时流行。随着近些年科技的进步，原有的标准已不能满足当前我国鸡病毒性关节炎诊断的技术需求，需要对原标准进一步完善。NY/T540-2023鸡病毒性关节炎诊断技术1范围本文件规定了鸡病毒性关节炎的临床诊断、病毒分离与鉴定、反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时荧光RT-PCR(Real-time RT-PCR)和间接ELISA抗体检测方法的技术要求。本文件适用于鸡病毒性关节炎的诊断、检疫、检测、监测和流行病学调查等。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用面构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，
6、仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用本文件。GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求3术语和定义下列术语和定义适用于本文件3.1鸡病毒性关节炎aianviral arthritis由禽呼肠孤病毒感染引起的鸡或火鸡的一种重要传染病4缩略语ESEARCH下列缩略语适用于本文件ARV:禽呼肠孤病毒(Avian Reovirus)CEF:鸡胚成纤维细胞(Chicken Embryonic FibroblastsCPE:细胞病变效应(Cytopathic Effect)ELISA:酶联免疫吸附试验(Enzyme L
7、inked Immunosorbent Assay)MEM:基础 Eagle 培养(Minimal Eagles Medium)PBS:磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffered Saline)RT-PCR:反转录-聚合酶链式反应(Reverse Transcription-polymerase Chain Reaction)Real-time RT-PCR:实时荧光反转录聚合酶链式反应(Real-time Reverse Transcription-polymeraseChain Reaction)SPF:无特定病原(Specific Pathogen Free)TAE:三羟甲基氨基
8、甲烷-乙酸-乙二胺四乙酸(Trihydroxymethyl Aminomethane-acetic Acid-ethyl-ene diaminetetra Acetic Acid)TMB:3,3,5,5-四甲基联苯胺(3,3，5,5-Tetramethyl-Benzidine)5临床诊断5.1流行病学5.1.1该病一年四季均可发生。5.1.2不同品种的鸡均可感染，但肉用型或肉蛋兼用型等体型较大的鸡多发。5.1.3不同日龄的鸡均可感染。5.1.4发病率高，死亡率较低，日龄越小越易感。雏鸡感染后，发病率和死亡率显著高于青年鸡和成年1NY/T540-2023鸡。日龄大的鸡感染后潜伏期较长，有的可耐过
9、。5.1.5该病可垂直传播，也可水平传播。5.2临床症状5.2.1病鸡精神沉郁，食欲减退，卧地倦动。5.2.2跗关节肿胀，腿变形，站立困难，跛行或单腿跳跃，严重病例瘫痪。5.2.3生长停滞、贫血、消瘦，日龄小的严重病例可逐渐衰竭死亡。5.3病理变化5.3.1剖检变化5.3.1.1跗关节和跖关节的剑鞘水肿，病鸡关节腔内有淡黄或淡红色渗出液，病程后期逐渐形成纤维素性渗出。5.3.1.2腿骨质脆，易折断。5.3.1.3肌腱断裂。5.3.2组织学病变5.3.2.1在急性期，出现水肿、凝固性坏死，异嗜细胞集聚血管周围浸润，网状细胞增生，最后引起腱鞘壁层明显增厚，滑膜腔充满异嗜细胞和脱落的滑膜细胞，随着破
10、骨细胞增生而形成骨膜炎。5.3.2.2在慢性期，滑膜形成绒毛样突起，并有淋巴样结节，大量纤维组织增生，明显见到网状细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和浆细胞的浸润或增生。趾关节和跗关节区也出现相同的一般炎症反应。5.4结果判定当鸡符合5.1且符合5.2、5.3之一的，可判定为疑似鸡病毒性关节炎。6样品采集和处理6.1器材6.1.1手术剪刀和镊子。6.1.2离心管。6.1.3样品保存管。6.1.4组织匀浆器。6.1.5采血器。6.1.6滤器（孔径0.22m)。6.2试剂6.2.10.01mol/LpH7.2PBS,配方应符合附录A中A.1的规定。6.2.2青素(4000 IU/mL)。6.2.3链素(4g/mL)。6.3样品采集6.3.1生物安全措施实验室生物安全措施按照GB19489的规定执行。6.3.2组织病料采集6.3.2.1活禽采样：灭菌棉拭子插人泄殖腔旋转2圈3圈后，放人含青霉素40001U/mL和链霉素4g/mL的无菌PBS样品保存管中。6.3.2.2病死禽采样：无菌采取肝脏、脾脏、肾脏等组织样品或者关节腔内容物样品，放人样品保存管中。6.3.3血清样品采集经翅静脉采集鸡血液，每只应不少于1mL。无菌分离血清，装人2mL离心管中，密封后28冷藏或一20冷冻保存。2