1、菌落总数菌落总数(zngsh)与大肠菌群的测与大肠菌群的测定定二、二、大肠菌群的检测大肠菌群的检测(jinc)一、一、菌落菌落(jnlu)总数测定总数测定法法第一页，共五十六页。目目前前(mqin)，食食品品卫卫生生标标准准中中的的微微生生物物指指标标一一般般分为分为菌落总数菌落总数、大肠菌群和致病菌大肠菌群和致病菌三项。三项。细菌计数细菌计数 食食品品中中菌菌落落总总数数通通常常指指1g，1ml或或1cm2面面积积食食品品上上的细菌数目而言的，而不考虑其种类。的细菌数目而言的，而不考虑其种类。由由于于检检测测计计数数方方法法的的不不同同,一一般般有有两两种种表表示示方方法法（菌落总数菌落总数
2、和和细菌总数细菌总数）。）。食品卫生标准中的微生物指标食品卫生标准中的微生物指标(zhbio)概论概论第二页，共五十六页。菌落(jnlu)总数:菌落菌落菌落(jnlu)：生长在固体培生长在固体培养基上，来源于一个细胞，养基上，来源于一个细胞，肉眼可见的细胞群体。肉眼可见的细胞群体。第三页，共五十六页。一一种种是是在在严严格格规规定定条条件件下下（样样品品处处理理，培培养养基基及及其其pH培培养养温温度度与与时时间间、计计数数方方法法等等），使使适适应应这这些些(zhxi)条条件件的的每每一一个个活活菌菌细细胞胞必必须须而而且且只只能能生生成成一一个个肉肉眼眼可可见见的的菌菌落落，经经过过计数所
3、获得的结果称为该计数所获得的结果称为该食品的菌落总数食品的菌落总数。第四页，共五十六页。另一种另一种是将食品经过适当处理（溶解和稀释）是将食品经过适当处理（溶解和稀释）后，在显微镜下对细菌细胞数进行直接计数，后，在显微镜下对细菌细胞数进行直接计数，这样计数的结果，既包括活菌，也包括尚未这样计数的结果，既包括活菌，也包括尚未被分解的死菌体，因此称为被分解的死菌体，因此称为细菌总数细菌总数。目前我国食品卫生标准目前我国食品卫生标准(biozhn)中规定的细中规定的细菌总数实际上是指菌落总数。即指的是在平菌总数实际上是指菌落总数。即指的是在平板计数培养基上长出的菌落数。板计数培养基上长出的菌落数。第
4、五页，共五十六页。那那么么检检测测(jin c)食食品品中中的的菌菌落落总总数数有有何何卫卫生生学学意意义义呢呢？一一方方面面，它它可可以以作作为为食食品品被被污污染染程程度度的的标标志志。检检测测食食品品中中的的菌菌落落总总数数，可可以以了了解解食食品品在在生生产产中中，从从原原料料加加工工到到成成品品包包装装受受外外界界污污染染的的情情况况从从而而反反映映食食品品的的卫卫生生质质量量。一一般般来来说说、菌菌落落总总数数越越多多，说说明明食食品品的的卫卫生生质质量量越越差差，遭遭受受病病原原菌菌污污染染的的可可能能性性越越大大。而而菌菌落落总总数数仅仅少少量量存存在在时时，病病原原菌菌污染的
5、可能性就会降低或者几乎不存在。污染的可能性就会降低或者几乎不存在。许许多多实实验验结结果果表表明明，食食品品中中细细菌菌总总数数能能够够反反映映出出食食品品的的新新鲜鲜程程度度、是是否否变变质质以以及及生生产产过过程程的的一一般般卫卫生生状状况况等等。一一般般来来讲讲，食食品品中中细细菌菌总总数数越越多多，则则表表明明该该食食品品污污染染程程度度越越重重，腐腐败败变质的可能性越大。变质的可能性越大。第六页，共五十六页。另另一一方方面面，它它可可以以(ky)用用来来预预测测食食品品可可能能存存放放的的期期限限程程度度。如如实实验验表表明明，菌菌数数为为105cfu/cm2的的鱼鱼，在在0下下可可
6、保保持持6d，而而菌菌数为数为103cfu/cm2时，保存期可达时，保存期可达12d。但但上上述述规规则则也也有有例例外外，有有些些食食品品成成品品的的菌菌落落总总数数并并不不高高，但但由由于于已已有有细细菌菌繁繁殖殖并并已已产产生生了了毒毒素素，且且毒毒素素性性状状稳稳定定，仍仍存存留留于于食食品品中中；再再有有一一些些食食品品如如酸酸泡泡菜菜和和酸酸乳乳等等，本本身身就就是是通通过过微微生生物物的的作作用用而而制制成成的的，且且是是活活菌制品。菌制品。第七页，共五十六页。自自然然界界细细菌菌的的类类很很多多，各各种种细细菌菌的的生生理理特特性性(txng)和和所所要要求求的的生生活活条条件
7、件不不尽尽相相同同，（如如嗜嗜温温菌菌30-37，4.83hr；嗜嗜冷冷菌菌 20-25 5-7d或或5-10 10-14d；嗜嗜热热菌菌 45-55 2-3天天）如如果果要要检检验验样样品品中中所所有有种种类类，必必须须用用不不同同培培养养基基及及不不同同培培养养条条件件去去满满足足其其要要求求，才才能能把把各各种种细菌都检验出来，这样工作量将会很大。细菌都检验出来，这样工作量将会很大。我我们们也也知知道道，自自然然界界尽尽管管细细菌菌种种类类很很多多，但但异异养养、中中温温、好好气气性性细细菌菌占占绝绝大大多多数数。因因此此，严严格格讲讲，用用这这种种方方法法所所得得到到的的结结果果，主主
8、要要是是一一些些能能在在平平板板计计数数琼琼脂脂培培养养基基上上生生长长的的，好好氧氧性性嗜嗜温温细细菌菌的的菌菌落落总总数数。但但是是把把它它们们作作为为细细菌菌总总数数已已得得到到公公认认。这这不不仅仅在在食食品品的的卫卫生生检检验验中中，而而且且在在一一切切微微生生物物区区系系分分析析中中，都都把把它它们们作作为为了了细细菌菌总总数的指标。数的指标。注注意意：是是并并不不是是所所有有食食品品都都规规定定细细菌菌指指标标，如如酸酸乳乳、酸酸泡泡菜菜等。等。第八页，共五十六页。因因此此，菌菌落落总总数数的的测测定定对对评评价价食食品品的的新新鲜鲜度度和和卫卫生生质质量量有有着着一一定定的的卫
9、卫生生指指标标的的作作用用(zuyng)，但但本本能能单单凭凭此此一一项项指指标标来来判判定定食食品品的的卫卫生生质质量量，还还必必须须配配合合大大肠肠菌菌群群和和致致病病菌菌等等检检验验，才能作出比较全面、准确的评价。才能作出比较全面、准确的评价。第九页，共五十六页。一、菌落一、菌落(jnlu)总数测定总数测定法法菌落总数菌落总数食品检样经过处理，在一定条件下培养后食品检样经过处理，在一定条件下培养后(如培养基成分、如培养基成分、培养温度和时间、培养温度和时间、pH、需氧性质等、需氧性质等)，所得，所得1mL(或或1g)检样中检样中形成菌落的总数。本标准规定的培养条件下所得结果，只包括形成菌
10、落的总数。本标准规定的培养条件下所得结果，只包括一群一群(yqn)在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌在平板计数琼脂上生长发育的嗜中温需氧菌或兼性厌氧菌的菌落总数。氧菌的菌落总数。第十页，共五十六页。GB/T 4789.2-2010本标准与本标准与GB/T4789.2-2008相比主要修改如下：相比主要修改如下：修改了标准的中英文名称；修改了标准的中英文名称；(食品安全国家标准食品微生物学检验 菌落总数测定/食品卫生微生物学检验食品卫生微生物学检验菌菌落总数测定落总数测定)修改了菌落总数计算公式中的解释；修改了菌落总数计算公式中的解释；修改了培养基和试剂；修改了培养基和试剂；删除了第
11、二法删除了第二法菌落总数菌落总数PetrifilmTM测试片法。测试片法。(培养基由营养琼脂改为平板计数培养基由营养琼脂改为平板计数(jsh)琼脂；琼脂；菌落总数计算公式进行了修改；菌落总数计算公式进行了修改；增加了第二法增加了第二法“菌落总数菌落总数PetrifilmTM测试片法测试片法”；)-2008第十一页，共五十六页。3.设备设备(shbi)和材和材料料 3.1恒温培养箱：恒温培养箱：361301。3.2冰箱：冰箱：25。3.3恒温水浴箱：恒温水浴箱：461。3.4天平：感量天平：感量0.1g。3.5均质器均质器3.6振荡器振荡器3.7无菌吸管：无菌吸管：1mL（具（具0.01mL刻度
12、）、刻度）、10mL（具（具0.1mL刻度）或微量移液器及其吸头。刻度）或微量移液器及其吸头。3.8无菌锥形瓶：容量为无菌锥形瓶：容量为250mL、500mL。3.9无菌培养皿：直径为无菌培养皿：直径为90mm。3.10pH计或计或pH比色管或精密比色管或精密pH试纸。试纸。3.11放大镜或放大镜或/和菌落计数器或和菌落计数器或PetrifilmTM自动判读自动判读(pnd)仪。仪。3.12无菌刀、剪子、镊子等无菌刀、剪子、镊子等。第十二页，共五十六页。4培养基和试剂培养基和试剂(shj)4.1平板计数琼脂培养基平板计数琼脂培养基(PlatecountagarPCA)，pH7.00.2 4.2
13、磷酸盐缓冲稀释液，磷酸盐缓冲稀释液，pH7.24.3无无菌菌生生理理盐盐水水(shnglynshu)：称称取取8.5g氯氯化化钠钠溶溶于于1000mL蒸蒸馏馏水水中中，1 2 1高高压压灭灭菌菌1 5 m i n。4.475%乙醇。乙醇。第十三页，共五十六页。细细 菌菌 学学 检检 验验 程程 序序-细菌总数细菌总数(zngsh)5、第一法第一法平板菌落计数法平板菌落计数法第十四页，共五十六页。6、操作步骤、操作步骤6.1.1固体和半固体食品：固体和半固体食品：以无菌操作称取以无菌操作称取25g样品，样品，放入于装有放入于装有225mL磷酸盐缓冲稀释液或磷酸盐缓冲稀释液或0.85生理盐生理盐水
14、的无菌均质杯内，于水的无菌均质杯内，于8000r/min10000r/min均质均质1min2min，制成，制成1:10样品匀液；或放入于样品匀液；或放入于225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min2min制成制成1:10的样品匀液。的样品匀液。6.1.2液体样品：液体样品：以无菌吸管吸取样品以无菌吸管吸取样品25mL放入装有放入装有225mL磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶磷酸盐缓冲稀释液或生理盐水的无菌锥形瓶(瓶内预置适当瓶内预置适当(shdng)数量的无菌玻璃珠数量的无菌玻璃珠)中，充分混匀，中，充分混匀，制成制成1:10的样
15、品匀液（的样品匀液（表面取样的样品按一定的比例制表面取样的样品按一定的比例制成成1:1样品匀液和样品匀液和/或或1:10样品匀液。样品匀液。）。）。6.1样品样品(yngpn)(yngpn)的稀释的稀释第十五页，共五十六页。6.1.3用用1mL无菌吸管或微量移液器吸取无菌吸管或微量移液器吸取1:10样品匀液样品匀液1.0mL，沿管壁缓慢注于装有，沿管壁缓慢注于装有9mL稀释液的无菌试管中（注意吸稀释液的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用管尖端不要触及稀释液），振摇试管或换用1支无菌吸管反复吹支无菌吸管反复吹打使其混合均匀，制成打使其混合均匀，制成1:100的样品匀液。的样
16、品匀液。6.1.4另取另取1mL无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺无菌吸管或微量移液器吸头，按上述操作顺序，做序，做10倍递增样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用倍递增样品匀液，如此每递增稀释一次，即换用1次次1mL灭菌吸管或吸头。灭菌吸管或吸头。6.1.5根据对样品污染情况的估计，选择根据对样品污染情况的估计，选择23个适宜稀释个适宜稀释度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别在做度的样品匀液（液体样品可包括原液），分别在做10倍递增倍递增稀释的同时，吸取稀释的同时，吸取1.0mL样品匀液于无菌平皿内，每个稀样品匀液于无菌平皿内，每个稀释度做两个平皿。同时分别取释度做两个平皿。同时分别取1mL稀释液加入稀释液加入两个无菌平两个无菌平皿皿作空白对照。作空白对照。6.1.6样品匀液移入平皿后，应及时将凉至样品匀液移入平皿后，应及时将凉至46平板计数琼脂平板计数琼脂培养基培养基(可放置于可放置于461恒温水浴恒温水浴(shuy)箱中保温箱中保温)注入平皿注入平皿约约15mL20mL，并转动平皿使混合均匀。同时将平板计数琼，并转动平皿使混合均匀。同时将平板计数琼脂培养基倾入脂培养基倾入加