1、细胞培养技术细胞培养技术(jsh)(jsh)第一页，共五十五页。p细胞培养也叫细胞克隆技术。p通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。因为生物产品(chnpn)都是从细胞得来，所以细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。最核心、最基础的技术。什么什么(shn me)(shn me)是细胞培养？是细胞培养？第二页，共五十五页。主要主要(zhyo)内容内容o实验设备实验设备o试剂及耗材试剂及耗材o清洗及灭菌清洗及灭菌(mi jn)(mi jn)o细胞培养细胞培养 （细胞生长过程，细胞来源，细胞复苏、传代及冻存，细胞计数，活力测定，细胞污染）第三页，共五十五页。一实验一实验(shyn)设备设备
2、o超净工作台，生物安全柜oCO2培养箱o倒置显微镜o离心机o电热恒温(hngwn)水槽o液氮罐o纯水仪o压力蒸汽消毒器o电热干燥箱第四页，共五十五页。超净台超净台 生物生物(shngw)安全柜安全柜 酒精灯（酒精灯（），），离开离开(l ki)(l ki)要熄灭要熄灭 ！酒精灯（酒精灯（）第五页，共五十五页。CO2培养箱培养箱nCO2培养箱设定(shdn)的条件为37，5CO2。倒置倒置(dozh)(dozh)显微镜显微镜第六页，共五十五页。离心机离心机电热电热(dinr)恒温水槽恒温水槽 液氮：-196 液氮罐液氮罐配平配平第七页，共五十五页。纯水仪纯水仪 压力蒸汽压力蒸汽(zhn q)灭菌
3、器灭菌器 电热干燥箱电热干燥箱由工作人员操作由工作人员操作(cozu)，注意安全！，注意安全！第八页，共五十五页。小结一实验设备小结一实验设备(shbi)及功能及功能o超净工作台，生物安全柜-操作平台操作平台oCO2培养箱-细胞生长的空间细胞生长的空间o倒置(dozh)显微镜-观察细胞观察细胞o离心机-离心收集细胞离心收集细胞o电热恒温水槽-加热加热o液氮罐-冻存细胞冻存细胞o纯水仪-制备一级水制备一级水o压力蒸汽消毒器-灭菌灭菌o电热干燥箱-烘干器皿烘干器皿（酒精灯安全（酒精灯安全(nqun)）第九页，共五十五页。二试剂二试剂(shj)及耗材及耗材o培养基培养基 o缓冲液缓冲液 o消化液消化
4、液o血清血清(xuqng)(xuqng)o其他其他o耗材耗材 第十页，共五十五页。培养基培养基 供给细胞营养和促使细胞增殖的基础物质，也是培养细胞生长(shngzhng)和繁殖的生存环境。成分及作用：成分及作用：氨基酸：组成蛋白质的基本单位碳水化合物：能量来源无机盐：帮助细胞维持渗透压平衡维生素：维持细胞生长的生物活性物质，在细胞代谢中起调节及控制作用第十一页，共五十五页。培养基分类培养基分类(fn li)DMEM（高糖高糖，葡萄糖4500mg/L）：成纤维、上皮细胞（293），一些实体瘤（Panc-1），原代神经元 DMEM（低糖低糖，葡萄糖1000mg/L）：间充质干细胞，单抗细胞融合RP
5、MI 1640：血液(xuy)细胞（HL60）、一些实体瘤细胞（BT474）酚红：酚红：PH指示剂（黄色过酸、紫色过碱）；酚红可以模拟固醇类激素的作用（特别是雌激素），涉及(shj)到激素和诱导的实验，建议选用无酚红培养基。ATCChttps:/www.atcc.org/美国模式培养物集存库第十二页，共五十五页。缓冲液（洗涤缓冲液（洗涤(xd)细胞）细胞）PBS：磷酸缓冲盐溶液具有(jyu)pH缓冲作用的等渗盐溶液（常规实验皆可用）。（Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl）D-PBS：杜氏磷酸缓冲液，磷酸盐含量稍低，含有钙镁离子，用于胚胎学方面的研究。Hanks：平衡盐溶液无机盐和葡
6、萄糖浓度接近大部分动植物细胞的水平，可作为动植物细胞短期培养(几个小时)。D-Hanks：不含钙离子、镁离子、葡萄糖（使用消化液时）。第十三页，共五十五页。消化液消化液o胰蛋白酶溶液胰蛋白酶溶液 使细胞间蛋白质水解、细胞离散。使用浓度0.25%。配制时要用不含Ca2+、Mg2+及血清（对胰酶产生抑制作用）的平衡盐溶液（如PBS、D-Hanks）。oEDTA溶液溶液一般用其钠盐，可溶性较好。有些组织需要Ca2+、Mg2+来保持其完整性，EDTA可以螯合这些离子(lz)，可使细胞之间裂解。其作用比胰蛋白酶缓和。使用浓度为0.02%，以无钙、镁的平衡盐溶液配制。o胶原酶溶液胶原酶溶液主要水解结缔组织
7、中胶原蛋白成分（用胰蛋白酶效果较差），使用Hanks溶 液 配 置，常 用 剂 量 为 最 终 浓 度200U/ml（约 为1mg/mL）。第十四页，共五十五页。提提供供基基本本营营养养物物质质、激激素素和和各各种种生生长长因因子子、提提供供结结合合蛋蛋白白、提提供供促促接接触触(jich)和和伸伸展展因因子子使使细细胞胞贴贴壁壁免受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保护作用。免受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保护作用。o保存血清最好的方法？保存血清最好的方法？建议血清保存在-20。解冻后存放于4时，请勿超过一个月。（分装）o如何解冻血清才不会使产品质量受损如何解冻血清才不会使产品质量受损
8、?建议从冷冻箱取出后，置于28冰箱使之缓缓慢慢解解冻冻、融融解解。使用时，必须将解冻的血清充充分分混混匀匀，并且勿将血清置于37太久。血清血清(xuqng)第十五页，共五十五页。青霉素青霉素-链霉素溶液链霉素溶液(rngy)(rngy)青霉素的工作浓度为100U/ml，链霉素的工作浓度为0.1mg/ml。分别阻止细菌细胞壁合成及细菌蛋白质的组成，达到抑制细菌生长的作用，防止(fngzh)污染，对真菌和支原体无效。其他实验所需的试剂其他实验所需的试剂：药物（如ATRA）、检测试剂（如MTT）、细胞因子（如SCF）等第十六页，共五十五页。试剂标注试剂标注(bio zh)规范规范o试剂名称 NaCl
9、o配制浓度 0.5 mMo配制人 张三(zhn sn)o配制日期 2016.10.21第十七页，共五十五页。耗材耗材o培养皿、瓶、孔板o离心管、移液管o枪尖o其他(qt)第十八页，共五十五页。小结二试剂及耗材的分类小结二试剂及耗材的分类(fn li)及用途及用途o培养基（成分、分类）o缓冲液（PBS、Hanks等）o消化液（分类及应用）o血清(xuqng)（作用、存储及解冻方法）o试剂标签要规范o耗材（分类(fn li)、用途）第十九页，共五十五页。o在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感在组织细胞培养中，体外细胞对任何有害物质都非常敏感,均能均能影响培养细胞的生长影响培养细胞的生
10、长n微生物产品附带杂物n上次细胞残留物n非营养成分的化学物质o需要清洗需要清洗(qngx)的培养用品的培养用品:玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。（包括：浸泡（洁消精）、超声波清洗、冲洗、烘干四个步骤）三清洗三清洗(qngx)及灭菌及灭菌第二十页，共五十五页。消毒灭菌消毒灭菌(mi jn)(mi jn)方法方法o物理消毒灭菌法物理消毒灭菌法nCo60辐射（辐射（射线）射线）：破坏生物大分子（塑料制品）n紫紫外外线线（200-300 nm）：30min，阻阻止止细细菌菌、病病毒毒核核酸酸合成。（合成。（细胞室：细胞室：用于空气，操作台表面等用于空气，操作台表面等）n湿湿热热（高高压压蒸蒸气气灭灭
11、菌菌法法）：121，20min，破破坏坏微微生生物物孢孢子子、蛋蛋白白变变性性。（用用于于大大量量液液体体、玻玻璃璃器器皿皿、部部分分塑塑料料耗耗材、手术器械等，由工作人员操作）材、手术器械等，由工作人员操作）n干干热热：160,2小时，高热作用下的氧化作用破坏微生物（耐高温的玻璃和金属制品）n过滤过滤(gul)：0.22m滤膜过滤除菌（少量试剂）第二十一页，共五十五页。消毒灭菌消毒灭菌(mi jn)(mi jn)方法方法o化学消毒灭菌法化学消毒灭菌法n75%酒精o主要用于操作者的皮肤，操作台表面及无菌室内的壁面处理（蛋白凝固）（不能擦拭有机玻璃(yujbl)）n1新洁尔灭o主要用于器械的浸泡
12、，皮肤和操作室壁面的擦试消毒（阳离子表面活性剂，能破坏细胞膜，改变其通透性而起杀菌作用）第二十二页，共五十五页。o需要清洗的物品：玻璃器皿、部分需要回收的塑料制品。o清洗的步骤o灭菌的方法：-紫外线（超净台、生物安全柜）-高压蒸汽灭菌（准备好放在准备室502）-75%酒精（表面(biomin)消毒，小心酒精灯明火）小结小结(xioji)三清洗及灭菌三清洗及灭菌第二十三页，共五十五页。四细胞培养四细胞培养o生长类型(lixng)o细胞来源o细胞复苏 o细胞传代o细胞冻存o细胞计数(j sh)o活力测定o污染种类第二十四页，共五十五页。细胞细胞(xbo)(xbo)的生长类型的生长类型 n 粘粘附附
13、型型细细胞胞：附着在某一固相支持物表面才能生长的细胞。（绝大多数正常细胞及实体瘤细胞）n 悬悬浮浮型型细细胞胞：不必(bb)附着于固相支持物表面，而在悬浮状态下即可生长的细胞。（主要是白血病细胞等）小鼠单核巨噬细胞白血病细胞(xbo)第二十五页，共五十五页。细胞细胞(xbo)(xbo)贴壁过程贴壁过程第二十六页，共五十五页。每代贴壁细胞的生长每代贴壁细胞的生长(shngzhng)过程过程o游离期游离期（接种后在培养液中呈悬浮状态（接种后在培养液中呈悬浮状态(zhungti)，细胞质回缩，细胞质回缩，细胞体圆球形）细胞体圆球形）o贴壁期贴壁期（细胞平均在（细胞平均在10分钟分钟4小时贴壁小时贴壁
14、，底物：胶原、玻璃、，底物：胶原、玻璃、塑料、其它细胞等）塑料、其它细胞等）o潜伏期潜伏期（有生长活动，而无细胞分裂，一般为（有生长活动，而无细胞分裂，一般为624小时小时o对数生长期对数生长期（细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳。（细胞数随时间变化成倍增长，活力最佳。最适合进行实验研究最适合进行实验研究）o停止期（平台期）（停止期（平台期）（细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。细胞长满瓶壁后，细胞虽有活力但不再分裂。机制：接触抑制、密度依赖性）机制：接触抑制、密度依赖性）（悬浮细胞没有贴壁过程）（悬浮细胞没有贴壁过程）第二十七页，共五十五页。o国内可以买到细胞株的地方有哪些？国内可以买到
15、细胞株的地方有哪些？oATCC（美国模式培养物集存库）国内代理oECACC（欧洲细胞株、微生物保藏中心）国内代理、sigmao中国科学院细胞研究所o中国医学科学院（协和(xih)医科大学）基础医学部o武汉大学冷藏中心等细胞细胞(xbo)来源来源第二十八页，共五十五页。o确定细胞株的培养确定细胞株的培养(piyng)信息（信息（ATCC）o配制培养基（基础培养基配制培养基（基础培养基+10%胎牛血清胎牛血清+双抗）、双抗）、胰酶、胰酶、PBSo无菌培养瓶、吸管、离心管的准备无菌培养瓶、吸管、离心管的准备准备准备(zhnbi)工作工作第二十九页，共五十五页。细胞细胞(xbo)复苏（快融）复苏（快融
16、）（l）从液氮中取出冷冻管，迅速投入37水浴中，使其融化（1分钟左右）。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染(wrn)情形。（2）用培养液稀释后低速离心10分钟。（3）去上清，加新鲜培养液培养刚复苏的细胞。（4）隔天换液，但贴壁细胞若未贴壁则勿需处理。复苏过程应快融，目的是防止小冰晶形成(xngchng)大冰晶而损伤细胞。第三十页，共五十五页。细胞细胞(xbo)传代传代 细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去(xi q)的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。第三十一页，共五十五页。细胞细胞(xbo)传代传代1 悬浮细胞悬浮细胞(xbo)传代传代o离离心心法法传传代代：离心（1000转/分）去上清，沉淀物加新培养液后再混匀传代。o直直接接传传代代法法：悬浮细胞沉淀在瓶底时，将上清培养液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成细胞悬液再传代。2 半贴壁细胞传代半贴壁细胞传代（Hela细胞）o此类细胞部分呈现贴壁生长现象，但贴壁不牢，可用直接吹打法使细胞从瓶壁脱落下来，