1、1CS65.020.01B16中华人民共和国国家标准GB/T29393一2012柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定Detection and identification of Candidatus liberobacter asiaticum2012-12-31发布2013-03-01实施中华人民共和国国家质量监督检验检按总局中国国家标准化管理委员会发布GB/T29393-2012柑桔黄龙病菌的检疫检测与鉴定1范围本标准规定了柑桔黄龙病菌亚洲种Candidatus liberobacter asiaticum jagoueix et al.的检测与鉴定方法。本标淮适用于植物检疫过程中对柑桔黄龙病菌
2、亚洲种的检测与鉴定。2病菌基本信息中文名：柑桔黄龙病菌。学名：Candidatus liberobacter asiaticum jagoueix et al.病害英文名：Citrus Huanglongbing HLB。属薄壁茵门Gracilicutes、韧皮部杆菌属Liberobacter。3方法原理根据柑桔黄龙病菌侵染柑桔植株发病典型症状进行田间鉴定；经嫁接或经柑桔术虱(Dia phori1acitri)传病后，可根据木本指示植物发病症状鉴定，聚合衝链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)检测技术对柑桔黄龙病菌DNA进行体外扩增，可得到快速、有效的鉴定结果。4
3、仪器及用具紫外线透射仪或凝胶成像系统，离心机，核酸电泳仪，pH计，移液器：10L、20L、100L、1000L,PCR仪，水浴器、超纯水系统，电子天平。5试剂与材料TAE缓冲液，三（羟甲基）氨基甲烷-盐酸(Tris-HCI),乙二胺四乙酸(EDTA),十二烷基硫酸钠(SDS),乙酸钠(NaAc),Taq酶，10XPCR缓冲液，25mmol/L镁离子(Mg2+),20mmol/L脱氧核苷三磷酸(dNTP),5LDNA荧光染料(GV),琼脂糖，溴酚蓝，高锰酸钾，三氯甲烷（氯仿），异戊醇，异丙醇，乙醇。6症状识别法柑桔黄龙病主要鉴定依据是田间出现的“叶片斑驳型黄化”和“黄梢”。叶片斑驳型黄化即叶片转
4、绿后从主、侧脉附近和叶片基部开始黄化，黄化部分打扩展形成黄绿相间分布不均的斑驳，后来可以全叶黄化。黄梢即在发病初期，绿色树冠上少部分新梢枝叶片黄化。有些柑桔结果树果实呈“红鼻子果”。在柑桔黄龙病区符合上述典型症状的病苗、病树可直接鉴定为柑桔黄龙病。对难以下结论的疑似病苗、病树，可根据具体情况选用以下一种或几种检测方法进行鉴定。GB/T29393-20127指示植物鉴定法7.1指示植物鉴定柑桔接穗带菌以槿柑作指示植物。鉴定时用带有2一3个病芽的接穗，在健康椪柑实生苗上进行嫁接。重复3次(嫁接工具每次使用前用高锰酸钾溶液消毒)。待嫁接愈合后，在其上方约1cm处剪除指示植物的主干，每株疑似病株至少嫁
5、接30株以上健康椪柑，以健康椪柑实生苗作对照，定期观察、记载指示植物新抽枝叶的症状。一般柑桔黄龙病在指示植物上的潜育期为412个月。符合第6章所描述的发病症状可鉴定为柑桔黄龙病。7.2指示植物鉴定柑桔木虱带菌从田间疑似病株上，采集柑桔木面成虫50一100头，接到指示植物椪柑上饲养，定期观察、记载指示植物症状。符合第6章描述的发病症状可鉴定接种柑桔木虱带有柑桔黄龙病菌。8PCR检测法8.1取样取样包括疑似柑桔黄龙病叶片和柑桔木虱成虫二类。采集疑似柑桔黄龙病叶每样品20张叶片，直接放于信封内（切忌塑料袋包装）。采集无病树和病树枝梢上柑桔木虱成虫每样品50100头，置于70%乙醇内浸泡2h3h,然后
6、取出放于塑料管内，供检测。样品可放入4冰箱保存。将取样情况填入植物有害生物调查抽样记录表（见附录A)。8.2方法按附录B的规定进行。8.3结果及判定每次扩增反应均设空白对照、来源可靠的阳性对照和不含病原DNA的阴性对照各1个，每个样品均进行3次重复。如果阳性对照电泳后出现一条563p特异性条带，阴性对照和空白对照电泳后没有条带，试脸结果成立，否则，结果不成立。在试脸结果成立的前提下，供试样品出现与阳性对照一样的条带，样品判定为阳性，即检出柑桔黄龙病菌：供试样品未出现与阳性对照一样的条带，样品判定为阴性，即不带柑桔黄龙病菌。9记录与档案将检结果坑人表格植物有害生物样本鉴定报告（见附录C),将检测的有关数据、图片等资料整理保存。10标本保存柑桔叶片放入4冰箱保存和柑桔木虱浸70%乙醇保存。