1、2023 年 第 4 期 化学工程与装备 2023 年 4 月 Chemical Engineering&Equipment 59 恶霉灵生产中的杂质的相关性研究 恶霉灵生产中的杂质的相关性研究 朱 敏，田俊生，金 周，左承治，高浩凯，常和西，刘铁斌（沧州蓝润生物制药有限公司，河北 沧州 611990）摘 要：摘 要：首次将恶霉灵生产中出现的四种杂质进行了分离，提纯，并通过核磁共振氢谱、碳谱及高分辨质谱等手段做了结构表征；同时，对部分杂质进行了独立的化学合成以确证其结构。为噁霉灵的生产提高产品纯度有极大帮助，并对市场价值有重大意义。关键词：关键词：恶霉灵；杂质研究；3-甲基-异恶唑-5-酮；3
2、,3-二甲基-2H-4,5二异恶唑-5-酮 恶霉灵（Hymexazol,3-羟基-5-甲基异恶唑,3）是一种高效新型广谱杀菌剂，同时也是植物生长促进剂。常用于土壤和种子消毒，它对镰刀菌、被孢霉和番茄丝核菌等多种真菌引起的植物疾病有显著的调节作用。图 1 是一条最适合于工业化生产的制备途径。这条合成路线是 1984 年由丹麦的 Jacobsen 等首次发表于加拿大化学杂志（Can.J.Chem.1984,62,1940.）1-2。其以乙酰乙酸甲酯(1)和羟胺为原料在 pH=10 左右，0-5反应得到羟肟酸(2)，然后在过量强酸中环合，最终以 70%的收率得到恶霉灵(3)。国内随后发表的有关合成路
3、线的文章，专利均是在 Jacobsen合成方法上的进一步优化和改进3-4。图 1 恶霉灵工业化生产的制备途径 图 1 恶霉灵工业化生产的制备途径 乙酰乙酸甲酯(1)和盐酸羟胺的氢氧化钠水溶液（pH=10）在室温混合后，羟胺优先进攻酮羰基生成肟(2a),图 1 生产中经过酸环合后形成 3-甲基-异恶唑-5-酮(3a)；分离纯化后得到 3-甲基-异恶唑-5-酮(3a)；其氢谱与文献数据完全一致7。图 2 以 Jacobsen 方法合成恶霉灵过程中典型的高压液相图谱 图 2 以 Jacobsen 方法合成恶霉灵过程中典型的高压液相图谱 图 2 是以 Jacobsen 方法合成恶霉灵过程中典型的高压液
4、相图谱。主峰显示产品恶霉灵(3）出现在 5.0 分钟，其异构体 3-甲基-异恶唑-5-酮(3a)在 4.3 分钟出峰，其他主要杂质分别出现在 4.9，6.3 和 7.4 分钟。为更好地控制生产和产品质量，我们对以上杂质进行了分离，提纯，和结构鉴定。1 材料与方法 1 材料与方法 1.1 仪器与试剂 99%盐酸羟胺(山东桓鑫化工有限公司)；99%乙酰乙酸甲酯（山东鸿程化学有限公司）氢谱，碳谱使用 Varian 300 MHz 核磁共振波谱仪(CDCl3 或者 DMSO-d6 为溶剂，TMS 作为内标)；高分辨质谱使用赛默飞Q Exactive;柱层析硅胶(300-400目)产自青岛海洋化工厂；实
5、验所用化学试剂产自天津希恩思（Heowns-Biochem Technologies LLC）。恶霉灵生产液相色谱条件:HITACHI Primaide Organizer C18 色谱柱(Hypersil ODS2 DOI:10.19566/35-1285/tq.2023.04.05360 朱 敏：恶霉灵生产中的杂质的相关性研究 5m ID 4.6mmx250mm);流动相为甲醇：水(含 0.1%磷酸）=1:1，等度洗脱；检测波长为 235 nm，运行 15min，流速0.8mL/min;柱温 25C;进样量 0.5L。1.2 杂质的分离，纯化，及结构鉴定 1.2.1 3-甲基-异恶唑-5-
6、酮(3a)4.3 分钟杂质的制备：将盐酸羟胺（7.2 克，0.1 mol）与水（10 毫升），和31%的氢氧化钠（13 克，0.1 mol）混合，搅拌下加入乙酰乙酸甲酯（11.6 克，0.1 mol）的水溶液（10 毫升），室温搅拌 1 小时,同时补加 31%的氢氧化钠（约 12 克）使 pH=9 10;然后将反应液加入预热至 50的 31%的盐酸（35 克）中环合；冷至室温后，将混合液用乙酸乙酯提取（2 X 40 毫升）；合并有机层，硫酸钠干燥，低温旋蒸浓缩得到油状物（收率 85%，纯度 92%）。1H NMR(300 MHz,CDCl3)/ppm 2.2(s,3H),3.4(s,2H)；1
7、.2.2 丙酮肟(acetone oxime 6)4.9 分钟杂质的制备：分离纯化：取恶霉灵原药重结晶时多次套用的甲苯母液（500 毫升），加入水（250 毫升），共沸蒸出甲苯；搅拌下向残余水液中加入 30%的氢氧化钠至 pH=9，过滤得到棕黄色固体。取以上棕黄色固体（10 克）与甲苯（20 毫升）室温搅拌 2 小时；过滤，滤液在旋蒸（40）上浓缩除去大部分溶剂（其极易升华，旋蒸时可见白色结晶附着在安全瓶上），将残液室温搅拌后有结晶析出，过滤得到白色结晶【液相纯度 99.5%】1H NMR(300 MHz,CDCl3)/ppm 1.88(s,3H),1.89(s,3H),8.94(br,1H)
8、；13CNMR(125MHz,CDCl3)/ppm 15.21,21.92,155.79;HRMS(ESI)M+H+Calcd.For C3H8ON:74.0606 found:74.0606;独立合成：将盐酸羟胺（7.2 克，0.1mol）与水（5 毫升），31%氢氧化钠（13 克）混合（pH=8.6）；搅拌下加入丙酮（11.6 克，0.2 mol）中，再加少许 31%氢氧化钠至 pH=9.8;将混合液在 45 加热 1 小时，然后冷至 5，并保温 1 小时，过滤得 3.7 克白色结晶（51%收率,液相纯度 99%），1H NMR 与以上分离所得 4.9 分钟杂质完全一致。1.2.3 化合物
9、 3,3-dimethyl-2H-4,5biisoxazolyl-5-one(7)6.3 分钟杂质的制备：取重结晶后的甲苯母液 1000 毫升，40时在旋蒸上浓缩得到残渣，以硅胶柱层析分离；二氯甲烷：乙酸乙酯（6：1）作为流动相并收集 Rf=0.78 展开剂：二氯甲烷：乙酸乙酯（3：1）+1 滴醋酸 的洗脱液，旋蒸挥去溶剂得到紫褐色结晶（液相出现在 6.3 分钟）。HRMS(ESI)M+H+Calcd.For C8H9O3N2:181.0613 found:181.0603;1.2.4 化合物 methyl 3-(3-methyl-5-oxoisoxazol-4(5H)-ylidene)but
10、anoate(8)7.4 分钟杂质的制备：取重结晶后的甲苯母液 1000 毫升，40C 时在旋蒸上浓缩得到残渣，以硅胶柱层析分离；以二氯甲烷：乙酸乙酯（4：1）作为流动相，收集 Rf=0.6（酮式）及 Rf=0.2（烯醇式）的洗脱液 展开剂：二氯甲烷：乙酸乙酯（3：1）+1 滴醋酸，旋蒸挥去溶剂得到土黄色结晶（液相出现在 7.4 分钟）。1H NMR(300 MHz,CDCl3)/ppm 2.3(s,3H,-CH3),2.5(s,3H,-CH3),2.6(s,-OH),3.8(s,3H,-OCH3),4.3(br,1H,-NH),6.3(s,1H,=CH);HRMS(ESI)M+H+Calcd
11、.For C9H12O4N:198.0766 found:198.0755;2 结果与分析 2 结果与分析 2.1 液相中 4.9 分钟杂质丙酮肟，6的分离，纯化及结构鉴定 该杂质与产品恶霉灵（5.0 分钟）在液相色谱上出峰位置接近，且相对含量很小。但其会在恶霉灵重结晶母液中不断富集，使用不同溶剂，在不同 pH，温度下，4.9 分钟的杂质被成功分离，提纯；其结构由氢谱,碳谱，高分辨质谱表征为丙酮肟(acetone oxime)。图 3 为 4.9 分钟杂质（丙酮肟，6）可能的生成过程:羟肟酸（2）可水解为乙酰乙酸（4），乙酰乙酸受热脱羧生成丙酮（5），其与羟胺生成丙酮肟（6）。图 3 4.9
12、分钟杂质（丙酮肟，6）可能的生成过程 图 3 4.9 分钟杂质（丙酮肟，6）可能的生成过程 朱 敏：恶霉灵生产中的杂质的相关性研究 61 另外，通过独立合成，丙酮肟的结构被进一步确证：在pH=8-9 时，将丙酮与盐酸羟胺在 45混合反应后得到丙酮肟白色结晶；其液相和氢谱与以上分离纯化得到的 4.9分钟杂质完全一致。2.2 液相中 6.3 分钟杂质 3,3-dimethyl-2H-4,5 biisoxazolyl-5-one(7)的分离，纯化及结构鉴定 根据粗品纯化情况，4.3 分钟，6.3 分钟，和 7.4 分钟的杂质可能部分或全部出现在恶霉灵原药中。以上杂质在原药中含量很低，但会在重结晶套用
13、的甲苯中逐渐富集，从而使分离纯化变为可能。取重结晶后的甲苯母液，浓缩得到残渣。以二氯甲烷：乙酸乙酯（6：1）作为流动相用硅胶柱层析分离。收集Rf=0.78 展开剂：二氯甲烷：乙酸乙酯（3：1）+1 滴醋酸的洗脱液；旋蒸挥去溶剂得到紫褐色结晶（液相出现在 6.3分钟）。高分辨质谱分析证明其结构为 3,3-dimethyl-2H-4,5biisoxazolyl-5-one（7），即 6.3 分钟杂质（7）是由 4.3 分钟杂质 5-异恶唑酮-3(3a)自身缩合而成（见图 4）。图 4 4.3 分钟杂质自身缩合成 6.3 分钟杂质（7）图 4 4.3 分钟杂质自身缩合成 6.3 分钟杂质（7）2.3
14、 液相中 7.4 分钟杂质 methyl 3-(3-methyl-5-oxoisoxazol-4(5H)-ylidene)butanoate（8）的分离，纯化及结构鉴定 与 6.3 分钟杂质的分离相同，将浓缩后的重结晶母液残渣进行硅胶柱层析，以二氯甲烷：乙酸乙酯（4：1）作为流动相，收集 Rf=0.6（酮式）及 Rf=0.2（烯醇式）的洗脱液 展开剂：二氯甲烷：乙酸乙酯（3：1）+1 滴醋酸，旋蒸挥去溶剂得到土黄色结晶（液相出现在 7.4 分钟）。氢谱，高分辨质谱分析证明其结构为（8）（见图 5），图 5 反应中化合物（8）是由 4.3 分钟的杂质（3a）与原料乙酰乙酸甲酯缩合而成。化合物（8
15、）未见文献报道，但 E.M.Beccalli 和 A.Marchesini 在 1989 年报道了其乙酯的合成5。图 5 4.3 分钟的杂质（3a）与原料乙酰乙酸甲酯缩合而成 图 5 4.3 分钟的杂质（3a）与原料乙酰乙酸甲酯缩合而成 3 结论与讨论 3 结论与讨论 恶霉灵作为杀菌剂和植物生长调节剂已经使用了二十多年，本文首次对恶霉灵生产过程中的四个杂质，其分别出现在高压液相的 4.3，4.9，6.3 和 7.4 分钟，进行了分离纯化及结构鉴定，并对部分杂质进行了独立的化学合成以确证其结构，本研究为生产纯白色噁霉灵提供了依据和帮助。通过本次试验研究 4.3 分钟杂质为 3-甲基-异恶唑-5-
16、酮(3a)；4.9 分钟杂质通过独立的化学合成以确证其结构为丙酮肟；6.3 分钟杂质 3,3-dimethyl-2H-4,5 biisoxazolyl-5-one(7)，为紫褐色结晶，是由 4.3 分钟杂质自身缩合而来；7.4 分钟杂质 methyl-3-(3-methyl-5-oxoisoxazol-4(5H)-ylidene)butanoate（8）未见文献报道，前人报道中仅提及过，可进一步研究。参考文献 参考文献 1 JACOBSEN N,KOLIND-ANDERSEN H,CHRISTENSEN J.Synthesisof 3-isoxazololsrevisited.Diketeneand-oxo esters as startingmaterialsJ.Can.J.Chem.,1984,62,1940.2 宋宝安,张建新,宋宝静,等,土壤杀菌剂恶霉灵的合成J.农药,1988,13.3 王中洋,韦能春,戴荣华,等.一种恶霉灵合成方法：CN,106946809AP.2017.4 林道广,熊剑,胡滔,一种 3-取代-4-异恶唑羧酸的合成方法：CN,103539753BP.2017