1、植物遗传资源学报 2023，24（3）：875-888DOI：10.13430/ki.jpgr.20221215002Journal of Plant Genetic Resources甘蓝型油菜叶片白化分子机理研究叶沈华，马晓伟，杨杰，李嘉欣，赵伦，易斌，马朝芝，涂金星，沈金雄，傅廷栋，文静（华中农业大学植物科学技术学院，国家油菜工程技术研究中心，武汉 430070）摘要：叶色突变体是研究色素代谢和叶绿体发育机制的重要种质资源。为解析甘蓝型油菜温度敏感型白叶突变体形成的分子机制，本研究对两个甘蓝型油菜人工合成种姊妹系绿叶株系G7097和白叶株系W7105进行了生理指标测定和转录组分析。在冬季
2、低温条件下，W7105白叶的叶绿素和类胡萝卜素含量显著减少，叶绿体发育异常。与绿叶相比，白叶的净光合速率（Pn）显著降低，细胞间CO2浓度（Ci）显著升高。在3个不同发育时期摘取G7097和W7105叶片进行转录组测序，共检测到1532个与叶色相关的差异表达基因（DEGs），包括540个上调的差异表达基因和992个下调的差异表达基因。GO和KEGG富集分析结果显示，W7105白化叶片中上调的差异表达基因显著富集在蛋白酶体、翻译过程、碳水化合物和能量代谢途径；而下调的差异表达基因则与叶绿体、光合作用和电子传递链显著相关。参与叶绿素和类胡萝卜素生物合成的多个基因在W7105白叶中下调表达，证实白化
3、叶片中叶绿素和类胡萝卜素代谢也受到了影响。研究结果为进一步定位和克隆甘蓝型油菜叶片白化关键基因以及阐述油菜白叶形成的分子机制提供了一定参考。关键词：白化；甘蓝型油菜；叶色；叶绿体发育；转录组Molecular Mechanisms of Albino Leaves in Brassica napusYE Shen-hua，MA Xiao-wei，YANG Jie，LI Jia-xin，ZHAO Lun，YI Bin，MA Chao-zhi，TU Jin-xing，SHEN Jin-xiong，FU Ting-dong，WEN Jing（College of Plant Science and
4、Technology of Huazhong Agricultural University，National Research Center of Rapeseed Engineering and Technology，Wuhan 430070）Abstract：Leaf-color mutants are crucial germplasms for deciphering the mechanisms of pigment metabolism and chloroplast development.In this study，to uncover the mechanisms of t
5、emperature-sensitive albino phenotype in Brassica napus，the physiological assessment and transcriptome analysis were performed in two resynthesized B.napus inbred lines，the white-leaf line W7105 and its green-leaf sibling line G7097.Under low temperature in field conditions，in albino leaves of W7105
6、，the chlorophyll and carotenoid content were dramatically decreased and chloroplast structure was abnormal.Compared with green leaves，albino leaves showed significantly lower net photosynthetic rate（Pn）and significantly higher intercellular CO2 concentration（Ci）.Transcriptome analysis of leaves at t
7、hree different developing stages was performed in G7097 and W7105 lines.After pairwise comparisons，a total of 1532 differentially expressed genes（DEGs）associated with leaf color phenotype were identified，including 540 and 992 genes that were up-regulated and down-regulated，respectively.GO and KEGG e
8、nrichment analysis showed that the up-regulated DEGs in albino leaves of W7105 were significantly enriched in proteasome，translation process，carbohydrate and energy metabolism pathways；while the down-regulated DEGs were significantly enriched in chloroplasts，photosynthesis and electron transport cha
9、in.Moreover，several DEGs in chlorophyll and carotenoid biosynthesis were significantly down-收稿日期：2022-12-13 修回日期：2022-12-27 网络出版日期：2023-01-21 URL：https：/doi.org/10.13430/ki.jpgr.20221215002第一作者研究方向为油菜遗传育种，E-mail：通信作者：文静，研究方向为油菜遗传育种，E-mail：基金项目：国家现代农业产业技术体系（CARS-12）；国家重点研发计划项目（2017YFD0101702）Foundati
10、on projects：China Agriculture Research System of MOF and MARA（CARS-12）；National Key Research and Development Program of China（2017YFD0101702）植物遗传资源学报24 卷regulated in albino leaves，suggesting that chlorophyll and carotenoid metabolisms were also impaired.Collectively，these findings provide references
11、 for further delimiting the candidate genes and uncovering the molecular mechanisms of albino leaves in B.napus.Key words：albinism；B.napus；leaf color；chloroplast development；transcriptome叶绿素缺乏突变体是研究叶绿素代谢、叶绿体发育和光合作用机制的理想遗传资源。在很多物种中都有报道，如水稻1、拟南芥2、大豆3和黄瓜4等。突变体叶色包括白化、浅绿、深绿、黄绿、金黄和紫色等多种颜色5。突变体的叶色表型可由细胞核基因
12、、细胞质基因和核-质基因相互作用的不同方式控制6。叶色突变体变异机制也比较复杂，主要是与叶绿素、类胡萝卜素和次生代谢物的合成、光合作用和叶绿体发育等生物过程有关。通过对植物白叶突变体的研究，研究者们已经发现了许多影响叶绿体发育的重要基因。叶绿体是半自主细胞器，大约有3000种核编码的蛋白质通过叶绿体包膜中的TOC/TIC蛋白运输复合体被转运进入叶绿体7。因此，TOC/TIC超级复合体对叶绿素的生物合成和叶绿体的发育至关重要。Bauer等8和Kohler等9分别研究了拟南芥苗期白化致死突变体toc159和tic56，证实了TOC/TIC复合体成员Toc159 和 Tic56 在叶绿体发育中的重要
13、作用。Toc159突变严重影响光合蛋白向叶绿体内的运输，形成的叶绿体缺乏类囊体和淀粉粒，最终表现白化表型8。与toc159一样，tic56-1同样具有严重的白化表型，叶片中只含有少量叶绿素且缺乏成熟的叶绿体9。核编码的RNA聚合酶（NEP）和质体编码的RNA聚合酶（PEP）是已知的控制叶绿体基因表达的两类调节因子10。PEP复合体能否发挥正常的功能需要 4 个核心亚基、PEP 关联蛋白和 因子（SIGs）的配合11。在拟南芥中，PEP关联蛋白类果糖激酶FLN1/FLN2与硫氧还蛋白TRXz相互作用，在调控PEP的转录活性中至关重要，其突变体均表现出叶片黄化以及叶绿体发育受到抑制的现象12-13
14、。最近，在水稻白化突变体 wlp2 中鉴定到1个新的PEP关联蛋白WLP2，它编码pfkB类的碳水化合物激酶，通过与TRXz结合共同调控PEP编码基因的转录，从而保证叶绿体正常发育和叶绿素积累14。温度敏感型白叶突变体是叶色突变体中的一种特殊类型，它在特定的环境条件或发育阶段下表现白叶，其他条件下保持比较正常的表型，因此能保证突变体可以正常结实并得以保存。通过对温度敏感型叶绿素缺乏突变体的研究，一些低温条件下质体发育和植物生长所需的相关基因已经被克隆。例如，水稻WLP1基因编码1个50S核糖体L13蛋白，该基因受低温诱导表达，wlp1突变体在23 低温条件下叶绿体结构异常，表现出白叶和白穗15
15、。TCD11基因编码核糖体S6小亚基蛋白，其突变导致水稻在20低温条件下叶绿体没有完整的内膜系统，叶绿素缺乏，从而表现出白叶致死表型16。GOLDEN2-LIKE（GLK）转录因子参与从叶绿体到细胞核的逆向信号转导过程，其靶基因是光合作用相关核基因（PhANGs），这些基因主要涉及叶绿素生物合成，或是具有编码天线蛋白、光系统亚基和电子传递链组分等功能，因此GLK也是很多植物中调控叶绿体发育所必需的17。在水稻和拟南芥中，glk1glk2双突变体叶绿素合成及光采集相关基因的转录和翻译水平降低，突变体的浅绿色表型也都伴随着缺陷的叶绿体生物合成和异常的叶绿体发育过程17。最近的研究指出，叶绿体的发育
16、及稳态不仅需要转录调控的密切配合，还涉及到一些翻译后过程的调节作用。额外的翻译后调节机制例如自噬过程和泛素-蛋白酶体系统（UPS）也都是调节叶绿体质量以应对环境胁迫的重要途径18-19。尽管在水稻、小麦、玉米等作物中已经鉴定出一批与质体发育有关的关键基因，但叶绿体发育的分子机理和调控网络仍有待完善。目前，已报道的甘蓝型油菜叶色突变体主要是黄化表型20，有关白化突变体的报道和相关研究很少。江莹芬等21在甘蓝型油菜中发现了1个角果特异性白化种质，该材料在苗期发育正常，但从现蕾期开始，花蕾、花瓣和角果均呈现白化性状，最终不能结实。前期通过远缘杂交获得了1个甘蓝型油菜白叶株系W7105，该株系苗期表现为受低温诱导的白化性状，可少量结实，是研究甘蓝型油菜叶绿体发育机制的重要种质资源。为进一步研究该白化材料的生理特性，揭示白化性状产生的分子机理，本研究对甘蓝型油菜白叶系W7105及其姊妹绿叶系G7097不同发育时期的叶片进行了转录组测序分析，并结合叶绿体超微结构观测，光合色素含量以及光合特性测定，找到一些可能与叶片白化相关8763 期叶沈华等：甘蓝型油菜叶片白化分子机理研究的关键基因。研究结果为定