1、论著基础研究 ：网络首发 ：（）通过调控 通道影响 分化为功能性胰岛细胞的机制研究郭鹏，谭烨，李文婧，丁钧（重庆医科大学附属第三医院：肝胆胰外科；消化内科，重庆 ）摘要目的探讨影响诱导性多能干细胞间充质样成纤维细胞（）分化为功能性胰岛细胞的分子机制。方法从健康成年小鼠胰腺中分离纯化间充质样成纤维细胞（），通过慢病毒将 、和 种转录因子转染至 ，诱导 转变为诱导性多能干性球体细胞（），并通过免疫荧光染色实验和 检测其是否表达瞬时受体离子电位通道蛋白（）；分别将蛋白激酶（）激动剂佛波醇酯（）和拮抗剂（）与 共孵育，通过荧光影像系统测定细胞内游离钙离子（）水平，观察 对 通道的调节关系。结果从成年小
2、鼠胰腺中成功分离纯化 ，该细胞群与骨髓来源的间充质干细胞（）有相似表面标志物（、和 ），并成功将 诱导为 ，且诱导后细胞表达 （、和 ）。与 激动剂共孵育后，使用磷脂酶（）途径刺激可见细胞内 未出现第高峰；而与 抑制剂（）共孵育后，使用 途径刺激细胞内 出现第高峰。结论 可负性调控 通道，从而影响 分化为功能性胰岛细胞。关键词型糖尿病；多能干细胞；转录因子；间充质干细胞；成纤维细胞；蛋白激酶；胰岛细胞 中图法分类号 文献标识码 文章编号 （），（.；.，）（）（），（）（）（）（），（，）（），（），（），重庆医学 年月第 卷第期基金项目：重庆市渝中区基础研究与前沿探索项目（）。作者简介：郭鹏
3、（），副主任医师，硕士，主要从事肝胆胰外科临床及基础研究。通信作者，：。；型糖尿病（）是一种自身免疫性疾病，主要由免疫介导胰腺细胞的破坏导致，其特征为胰岛素绝对缺乏引起的高血糖。根据国际糖尿病联合会数据，年约有 亿成年人罹患糖尿病，其中近为 。目前，主要治疗方法是注射胰岛素，该方法虽然能取得良好的效果，但胰岛素用量较难控制，伴随许多严重并发症，如酮症酸中毒、低血糖症等；胰腺移植、胰岛移植等治疗方案也可获得较好的疗效，但供体组织短缺使这些治疗方式应用严重受限，而且还需要对免疫抑制剂的副作用进行严格控制。随着干细胞技术飞速发展，再生医学已成为损伤修复的研究热点。等率先报道了有关诱导性多能干细胞（，
4、）的研究。随后大量研究报道 可以定向分化为胰腺系细胞，用于 的再生治疗，干细胞疗法有望成为糖尿病治疗的有效治疗新方法。但 定向分化为胰腺系细胞的分子机制尚不完全清楚。钙离子（）是重要的第二信使信号分子，在细胞分化过程中起着非常重要的作用。瞬时受体离子电位通道蛋白（，）是位于细胞膜和内质网重要的非选择性阳离子超家族通道蛋白，与 水平密切相关。有研究报道，调节细胞内 水平可诱导 分化为功能性细胞 。等 发现，通过 调节细胞内 水平可诱导胚胎干细胞（细胞）向神经细胞分化。而 细胞向神经干细胞的分化作用可被蛋白激酶（）抑制剂 或 激活 剂 调节。但关于 在 诱导分化为样细胞过程中是否发挥相同作用未有相
5、关报道。本研究将成年小鼠胰腺分离纯化的间充质样成纤维细胞（，）通过基因转染技术诱导生成诱导性多能干细胞 （），并通过抑制或激活 检测细胞内 水平，从而探究 在 分化为样细胞过程中发挥的作用。材料与方法 材料 实验动物选择遗 传 背 景 为 的 野 生 型 成 年 小 鼠（龄）只，均饲养于无特殊病原体（）级动物室，所有实验操作遵守重庆医科大学伦理委员会规定，动物实验伦理批准号：年伦审第（）号。仪器与试剂胰蛋白酶（批号：）、明胶（批号：）、聚凝胺（批号：）均购自美国 公司，小鼠细胞分层液（批号：）、培养基（批号：）均购自美国 公司，胎牛血清（，批号：）购自美国 公司，蛋白裂解液（批号：）购自美国
6、公司，蛋白浓度测定试剂盒（批号：）购自上海碧云天生物技术有限公司，病毒质粒包裹转染系统（批号：）购自美国 公司，平衡盐溶液 ，含 、葡萄糖、羟乙基哌嗪 乙磺酸（），。纯水仪（美国 公司）、蛋白凝胶成像系统（法国 公司）、微量移液枪（德国 公司）、倒 置 荧 光 显 微 镜（日 本 公 司）、细胞培养箱（美国 公司）及 激光共聚焦显微镜（德国 公司）。方法 的分离与纯化取成年小鼠胰腺，体积比胰酶:乙二胺四乙酸（）:消化小块胰腺组织，后用小鼠细胞分层液（连续密度梯度离心法）离心分层。用 离 心 管 先 后 缓 慢 注 入 工 作 原 液（与 体积比:混合）、工作液（因胰腺间充质干细胞的悬浮密度为
7、，可悬浮在 工作液层中）和 工作液各，然后缓慢注入制备好的胰腺单细胞悬液（比例为:），平稳放入水平离心机后，离心 ，吸去表层培养液，抽取所需层面细胞进行原代培养，并接种于含 的培 养 液 中，转 入 孵 箱，、饱和湿度下培养。后全量换液，之后每天换液，去除非贴壁细胞，约 后即可传代，两次传代后获得实验所需 。对 进行 诱导实验将 个分离纯化的 置于 明胶覆盖处理，在含 的 中培养，第天加入聚凝胺，终浓度为。采用包含种干性转录因子（、及 ）的单病毒质粒包裹转染系统 最佳感染复数（）范围 对 进行转染，转染时间约。转染 后，用未加聚凝胺的成纤维细胞培养基换液。后，用无血清 细胞培养基换液。和 生物
8、学特性鉴定使用免疫荧光染色和 检测 是 否 表 达 、和 ，检 测重庆医学 年月第 卷第期 中是否表达 。细胞内 水平测定细胞生长于明胶处理载玻片上，、钙离子荧光探针 孵育 ，室温等渗 缓冲液清洗。载玻片放入温控小室循环系统（美国 公司）并连接至倒置荧光显微镜（日本 公司）。缓冲液 流速持续灌洗细胞表面。激动剂佛波醇酯（）和拮抗剂（）缓冲液与细胞作用 后转换正常 缓冲液。应用 超快离子荧光影像系统（美国 公司）测定细胞内游离 水平，影像和光学刺激信号交替于波长 （），监测 处的发射波长，计算机软件自动测量校正和记录所得结果。结果 分离纯化的 与骨髓来源的 具有相似的表面标志物首先 从 成 年
9、健 康 小 鼠 胰 腺 中 成 功 分 离 纯 化 ，并进行细胞培养，原代培养时细胞生长缓慢，传代后增殖保持稳定生长（图、）。为确定前期分离纯化的 与骨髓来源的间充质干细胞（）形态和表面标志物是否相似，采用免疫荧光染色实验检测发现，与 均表达 （图 、）；采用 检测发现，也表达 标志物 和窦周细胞标记物 （图），表明分离纯化的 具有与骨髓来源的 相似的形态和表面标志物。的诱导形成为了获得具有干性功能的 ，将种关键性的 细胞干性转录因子（、和 ）转染到 ，使 转变为球体细胞 。转染后的球体细胞 生长稳定，而且再生能力强（图），表明成功诱导出了 。：第 天原代培养中的 （）；：传代后稳定生长的 （
10、）；：表达 （免疫荧光染色，）；：骨髓来源的 表达 （免疫荧光染色，）；：检测 中 和 表达。图成年小鼠胰腺分离纯化的 表达 、和 ：培养后的 （）；：培养后的 （）；：稳定后自我更新的 （）。图 的诱导形成 对 通道的影响为探究 对 的影响，首先通过免疫荧光染色实验证实 表达 、和 （图、）。然后分别将 激动剂（）和拮抗剂（）与 共同孵育，通过荧光影像系统测定细胞内游离 水平，观察 对 通道的相互调节关系，结果显示：与 抑制剂（）共孵育后，经磷脂酶（）途径刺激后细胞内 出现第个高峰（图）；而与 激动剂（）共孵育后，使用 途径刺激未见细胞内 出现第个高峰（图）。重庆医学 年月第 卷第期：表达
11、（、和 ）；：表达 （、和 ）。图免疫荧光染色实验检测 和 表达 （）：与 共孵育；：与共孵育。图 反馈性调节 的 通道讨论 分化为胰腺细胞技术有望治愈 。目前关于使用 疗法治疗 的研究还处于实验室研 究 阶 段，大 多 方 法 是 首 先 通 过 种 转 录 因 子（、）将体细胞转化为具有多种分化能力的多能细胞，然后通过调节各种多能干细胞的生存通路和分化通路，将这些多能细胞从原始状态逐步分化成为内胚层细胞、原始肠管细胞、后前肠细胞、胰腺内胚层细胞、内分泌前体细胞，最后分化成为胰岛细胞。但 诱导产生胰岛细胞的效率很低，这一缺点限制了通过 诱导产生胰岛细胞的应用。为了提高 向胰岛细胞转化的效率，
12、最近 等 报道了一种新方法，该研究建立了肌动蛋白细胞骨架的状态与驱动胰腺谱系的胰腺转录因子表达之间的联系，通过靶向细胞骨架促进 向胰岛细胞分化。研究人员将分化出的细胞移植到 小鼠体内，发现 小鼠可以维持正常血糖至少个月，但该方法的有效性必须在体型更大的动物实验中进行验证，同时需要找到一种新的自动化方法，产生更多的细胞。因此，探索提高 向胰岛细胞转化效率的新方法是实现其应用的必要前提。是位于细胞膜和内质网的重要非选择性阳离子超家族通道蛋白，其开放状态与细胞内 水平密切相关，而作为第二信使信号的 在细胞分化中具有非常重要的作用。有研究发现，可以通过调控 水平诱导 分化为功能性细胞，如分化为神经细胞
13、、心肌细胞和骨细胞等 。等 发现，诱导 细胞向神经细胞分化可以通过 调节细胞内 水平实现。而这种分化作用既可被 抑制剂（）激活，又可被 激活剂（）抑制。据此，可以假设将成年小鼠胰腺本身分离纯化的 通过 基因转染技术诱导为多能干细胞（），继而借助 调控 细胞内 水平，抑制 信号传导通路，促使 向胰岛细胞分化，这可能是提高 向胰岛细胞转化效率的新方法。为了验证上述假设，本研究首先从小鼠胰腺中分离纯 化 ，然 后 采 用 慢 病 毒 将 、和 基因转染到 ，完成基因再编码过程，得到 。通过采用 激活剂（）与 共孵育后，检测到细胞内 水平未出现第个峰，表明 的激活重庆医学 年月第 卷第期抑制 了 通
14、道；而 采 用 抑 制 剂（）与 共孵育后，检测到细胞内 水平出现第 个峰，表明 的抑制激活了 通道。基于此，可以得出结论，通过负性调控 通道调节 分化为功能性胰岛细胞的能力。综上所述，本研究的发现为提高 向胰岛细胞转化的效率提供了新思路和新方向。不过后续研究还需要比较加 抑制剂和加 激活剂的 的分化状态，进一步确证 在 分化为功能性胰岛细胞中的具体作用。参考文献 ，：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（下转第 页）重庆医学 年月第 卷第期 ，：，（）：陆效笑，陆春梅，王来栓，等 基因致病变异所致新生儿期大疱表皮松解症 例病例系列报告 中国循证儿科杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，：（），：吕雪，李昊，刘红彦，等 基因复合杂合变异所致的隐性营养不良型大疱性表皮松解症家系的遗传学分析 中华医学遗传学杂志，（）：，（）：，（）：刘宁，郭宏湘，孔祥东，等 营养不良性大疱性表皮松解症 基因诊断及产前诊断 中华医学杂志，（）：，：，（）：，（），（）：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：修回日期：）（上接第 页），（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：修回日期：）重庆医学 年月第 卷第期