1、生物信息学 ：网络首发 ：（）和 对乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移和患者生存预后的影响匡思杰，成宏，孙敬杰（恩施土家族苗族自治州中心医院乳腺外科，湖北恩施 ；解放军总医院海南医院肿瘤内科，海南三亚 ）摘要目的鉴定影响乳腺癌患者生存预后的肿瘤特征，探究酸敏感离子通道（）和过氧化物酶样蛋白（）对乳腺癌细胞增殖、侵袭、迁移和患者生存预后的影响。方法利用单样本基因富集分析（）和 回归分析评估不同肿瘤特征与乳腺癌预后的相关性，加权基因共表达网络分析（）鉴定与肿瘤特征相关性最高的基因模块，寻找与缺氧有关的关键基因（基因），利用细胞功能实验对所得到的基因进行验证。结果 种肿瘤特征中，缺氧（，）、血管生成（，）、
2、肿瘤干性（，）、细胞周期（，）、损伤（，）、修复（，）与乳腺癌患者生存明显相关。其中缺氧通路评分对乳腺癌患者生存有明显影响。针对缺氧有关的 基因进行分析，共得到个 基因：酪氨酸酶相关蛋白（）、蛋白酪氨酸磷酸酶型受体（）、，其中 表达与乳腺癌患者生存明显相关（），低表达患者生存预后较差；表达与乳腺癌患者生存明显相关（），高表达患者生存预后较差。细胞功能实验结果显示，当乳腺癌细胞 表达下调，乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力均被抑制；而 则呈现相反的效应。结论 和 对乳腺癌增殖、侵袭和转移有明显影响，与患者生存预后相关，参与乳腺癌的进展。关键词乳腺癌；加权基因共表达网络分析；单样本基因富集分析；酸敏
3、感离子通道；过氧化物酶样蛋白 中图法分类号 文献标识码 文章编号 （），（.，；.，），（）（），（）（）（），（，），（，），（，），（，），（，），（，）重庆医学 年月第 卷第期基金项目：恩施州科技计划指导性项目（）。作者简介：匡思杰（），住院医师，硕士，主要从事乳腺、甲状腺疾病研究。通信作者，：。，（），（），（），；（），；乳腺癌来源于乳腺腺上皮组织，是影响女性生命健康最重要的恶性肿瘤之一。国际癌症研究机构（，）最新报告显示，在全球范围内，乳腺癌的发病率已超过肺癌，成为发病率最高的恶性肿瘤。在世界范围内，乳腺癌的新发病例占所有恶性肿瘤新发病例的 ，占女性恶性肿瘤新发病例的 ；死亡人数约
4、占所有恶性肿瘤死亡人数的，占全球女性癌症死亡人数的 ，是造成全球女性死亡人数最多的恶性肿瘤。乳腺癌的发病因素较多，主要有遗传因素、致癌性 病毒感染、内分泌紊乱、肥胖、精神心理因素、药物因素等。除此之外，造成近年来乳腺癌发病率激增的主要原因还包括生育率下降、缺乏适当运动等。对于发达国家，乳腺癌患者的年生存率较高，的患者多具有较好的生存预后；而在发展中国家和一些低收入国家，该病的死亡率大大升高，严重威胁了社会经济的发展。乳腺癌患者的生存预后可能与多种因素有关，如疾病分期、分子分型、表观遗传学改变、基因表达。现阶段寻找与乳腺癌预后相关的主要因素，进而研发相应靶向药物，对延长患者生存时间、改善预后有重
5、要意义。因此，本研究通过分析患者基因表达与预后的关系，筛选与预后相关的重要肿瘤特征，据此寻找与其相关的重要基因模块，鉴定与缺氧有关的关键基因（基因），最后将鉴定出的基因进行实验验证，证实其与乳腺癌生存预后的相关性及对乳腺癌进展的影响，为后续靶向药物的开发和相关分子机制的探讨提供理论依据。资料与方法 一般资料于 （：）下载并筛选具有完整生存预后信息的乳腺癌患者转录组测序数据。下载获取患者表型信息和预后数据，包括：总体生存时间、生存状态、年龄、性别、分期、分期、分 期、肿 瘤 分 级 等。于 （：）获取 种肿瘤特征文件，包括：血管生成、细胞凋亡、细胞周期、细胞分化、损伤、修复、上皮间质转化（）、缺
6、氧、炎症、侵袭、转移、增殖、干性、静止。方法 单样本基因富集分析（）量化患者肿瘤特征利用软件（版本号：）中 包计算 种肿瘤特征评分。下载并整理癌症基因组图谱数据库乳腺癌组织转录组测序数据，将其与基因集文件放入同一文件夹，利用 软件 包对各乳腺癌组织 种肿瘤特征进行评分。设置参数：方法为 ，为 ，为 ，为，为，为 ，为 ，最终得到各乳腺癌组织 种肿瘤特征的评分情况。利用 包 对 各 患 者 肿 瘤 特 征 评 分 进 行 可视化。加权基因共表达网络分析（）利用 对乳腺癌患者的转录组数据进行筛选，得到与乳腺癌患者生存预后密切相关，且与缺氧有关的基因模块。利用软件 包对乳腺癌组织基因表达矩阵进行分析
7、，结合乳腺癌患者总体生存时间、生存状态、年龄、性别、分期、分期、分期、肿瘤分级、缺氧评分等表型，筛选与各表型有密切联系的通路模块，得到与生存预后、缺氧明显相关的基因模块，并进行后续分析。基因分析利用 的 插件进行 基因分析。通过 对所得到的与乳腺癌预后明显相关的基因进行共表达分析，对网络结构和节点重庆医学 年月第 卷第期间加权重联系进行计算，寻找并鉴定 基因。载体构建与细胞转染首先构建关键基因的 片段，其中酸敏感离子 通 道（）靶 序 列 ，过氧化物酶样蛋白（）靶序列 。将已通过细胞鉴定的乳腺癌细胞系（、）从液氮管中取出，立即放入 水浴锅摇晃复苏。在超净台中，加入等体积的培养基离心，弃掉上清液
8、，用含 胎牛血清的培养基重悬细胞后接种于 培养瓶，放入 孵箱培养。取生长状态良好的细胞行 转染操作。将细胞系用胰蛋白酶消化后于孔板中铺板，细胞接种密度使其第天汇合度 为宜，接种后继续培养。第天进行转染操作：向无酶无菌的 管加入 培养基和 ，充分混匀（溶液），静置 。向无酶无菌的 管中分别加入 培养基和 和阴性对照，混匀（溶液），静置 。将上述、溶液混合，静置 。将转染混合液均匀加入孔板中，放入培养箱培养。转染过后的细胞用做后续实验。细胞增殖实验细胞转染 可采用 和 行细胞活力检测。将转染后的乳腺癌细胞消化转入 细胞离心管中，细胞计数仪计数。根据计数结果，加入细胞培养基并调整细胞数至 。用 孔板
9、（孔）和 孔板（孔）接种细胞悬液，每孔重复次。将孔板放入细胞培养箱中，正常培养。实 验：后 在 超 净 台 上，每 孔 加 入 试剂，孵育。用酶标仪测量细胞在 波长处的吸光度（）值并记录。连续测量细胞活性。实验：根据说明书，按照 标记、细胞固定、染色、细胞核 染色、荧光检测步骤完成实验操作。细胞迁移和侵袭实验细胞转染 后，胰蛋白酶消化乳腺癌细胞，转移至 离心管中，通过细胞计数仪计数。加入无血清的培养基重悬稀释细胞并调整至。将 小室水平放入 孔板中（对于侵袭实验，小室中预先加入培养基稀释后的 ，放入细胞培养箱中孵育），取 细胞液加入小室上层，然后小室下层缓慢加入含有 血清的完全培养基 ，注意不要
10、产生气泡。放入培养箱中培养 。取出孔板中的小室，用细胞固定液固定 后，放入结晶紫染料中染色 。染色完成后立即用磷酸盐缓冲液（）清洗干净，干燥后于显微镜观察拍照。实时荧光定量逆转录 （）引物通过美国国立生物技术信息中心（）数据库在线设计，并经 验证产物特异性。引物长度范围在 个碱基对，值约 ，选择 含量为 ，由重庆擎科生物公司合成。使用超纯 试剂盒（江苏康为世纪生物科技股份有限公司）从组织或细胞中提取总 。浓度用 分光光度计测定。使用 试剂盒和 试剂盒（日本 公司）进行反转录及荧光定量反应。采用 法计算 相对表达水平，以磷酸甘油醛脱氢酶（）为内参。统计学处理采用语言 包对各肿瘤特征进行评分，包寻
11、找协同表达的基因模块及其与表型的关联，包进行 回归分析，包进行单因素、多因素 比例回归分析。热图的绘制采用 包。利 用 （：）进行生存分析，（：）进行基因表达分析。全文统计分析的值均为双侧，以 为差异有统计学意义，所有 分析均使用 完成。结果 鉴定影响乳腺癌进展的重要肿瘤特征利用 对乳腺癌患者各肿瘤特征进行量化后比较，包括：血管生成、细胞凋亡、细胞周期、细胞分化、损伤、修复、缺氧、炎症、侵袭、转移、增殖、干性、静止等。不同生存状态的乳腺癌患者各肿瘤特征评分比较，见图。将患者预后信息与肿瘤特征评分结合分析，回归显示：缺氧（，）、血管生成（，）、肿瘤干性（，）、细胞周期（，）、修复（，）、损伤（，
12、）等通路特征与患者生存明显相关，见表。其中，缺氧通路最高，高缺氧评分组患者生存率明显低于低缺氧评分组（），见图；结局为死亡的乳腺癌患者缺氧通路评分明显高于存活患者（），见图。鉴定与缺氧相关的主要基因模块利用 能进行模块化分析的优势，寻找与缺氧通路明显相关的基因模块。对乳腺癌患者转录重庆医学 年月第 卷第期组测序数据及表型数据（年龄、性别、生存状态、分期、分期、分期、肿瘤分级、缺氧通路评分）进行 ，共得到 个基因模块，见图、。其中 模块与患者生存情况呈正相关（，），见图。将各表型与基因模块进行相关性分析，发现 模块与年龄呈负相关（，）；模块与 分期呈负相关（，）；模 块（，）、模块（，）、模块（
13、，）与缺氧通路评分均呈正相关，见图。其中，模块与患者预后呈正相关（，）。：乳腺癌患者各肿瘤特征 评分热图；：缺氧通路评分对乳腺癌患者生存的影响；：不同预后乳腺癌患者缺氧通路评分比较；：。图影响乳腺癌进展肿瘤特征的鉴定：基因聚类树和模块切割；：样本聚类树和患者表型热图；：紫色模块基因与患者预后的关系；：各基因模块与患者表型的关联热图。图 鉴定与缺氧相关的主要基因模块表 回归分析评估各肿瘤特征与乳腺癌患者预后的相关性特征回归系数的 缺氧 血管生成 分化 干性 转移 重庆医学 年月第 卷第期续表 回归分析评估各肿瘤特征与乳腺癌患者预后的相关性特征回归系数的 上皮间质转化 炎症 静止 侵袭 细胞周期
14、增殖 凋亡 修复 损伤 鉴定缺氧特征中影响乳腺癌预后的重要基因 模块共包含 个基因，经过单因素分析、回归筛选（图）、回归分析后，最终得到 个影响乳腺癌预后的重要基因：、透明带糖蛋白（）、心脏型肌钙蛋白（）、具有血小板结合蛋白结构域的去整合素金属蛋白酶（）、钾离子通道蛋白（）、组蛋白（）、内向整流钾离子通道（）、组织因子通道抑制因子（）、乙酰胆碱受体 亚基（）、谷氨酸受体红藻氨酸离子（）、神经肽 受体（）、糖蛋白（）、表皮生长因子样结构域蛋白（）、金属硫蛋白（）、型鸟苷酸交换因子（）、原钙黏附蛋白（）、原钙黏附蛋白 （）、趋化因子受体（）、肌腱蛋白（）、调节蛋白和肌球蛋白接头（）、增强子结合蛋白
15、（）、父系表达基因（）、和 样家族蛋白（）。：回归交叉验证曲线；：危险因素的 系数路径图。图利用 回归分析筛选缺氧通路中影响乳腺癌患者预后的关键基因 鉴定影响乳腺癌预后的缺氧相关 基因对所得到的 个基因做进一步分析，寻找与缺氧有关的 基因。利用 的 插件对与缺氧有关的 基因进行分析，共得到个 基因：酪氨酸酶相关蛋白（）、蛋白酪氨酸磷酸酶 型受体（）、。生存分析与基因表达分析发现：表达与乳腺癌患者生存明显相关（），低表达的患者生存预后较差，见图；表达与乳腺癌患者生存明显相关（），高表达患者生存预后较差，见图。和 表达水平与乳腺癌患者临床资料的相关性见表、。重庆医学 年月第 卷第期：对乳腺癌患者生
16、存预后的影响、：对乳腺癌患者生存预后的影响；：对乳腺癌患者生存预后的影响；：对乳腺癌患者生存预后的影响；：基因表达；：基因表达；：基因表达；：基因表达。图 基因在乳腺癌的生存分析和表达水平表 表达水平与乳腺癌患者临床资料的相关性临床指标 低表达组（）高表达组（）生存状态（）存活 （）（）死亡（）（）年龄（，岁）性别（）女 （）（）男（）（）分期（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）分期（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）分期（）（）（）（）（）（）（）续表 表达水平与乳腺癌患者临床资料的相关性临床指标 低表达组（）高表达组（）肿瘤分期（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）表 表达水平与乳腺癌患者临床资料的相关性临床指标 低表达组（）高表达组（）生存状态（）存活 （）（）死亡（）（）年龄（，岁）性别（）女 （）（）男（）（）分期（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）重庆医学 年月第 卷第期续表 表达水平与乳腺癌患者临床资料的相关性临床指标 低表达组（）高表达组（）分期（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）（）分期（）（）（）（）（）（）（）肿瘤分期（）（）（）