1、免疫细胞(xbo)功能检测技术,第一页，共四十三页。,一 淋巴细胞的功能(gngnng)检测,淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。体内实验主要是间接了解(lioji)淋巴细胞对抗原、半抗原或有丝分裂原的应答反应；体外实验主要包括淋巴细胞对抗原或有丝分裂原刺激后的增殖反应、细胞毒性试验及淋巴细胞分泌产物的测定,第二页，共四十三页。,淋巴细胞,T细胞(xbo)（负责细胞(xbo)免疫功能）B细胞（执行体液免疫功能）NK细胞（非特异性免疫作用）,第三页，共四十三页。,一、T细胞(xbo)功能的检测,T细胞增殖(zngzh)试验T细胞分泌功能测定T细胞介导的细胞毒试验体内试验,第四页，共四十三页
2、。,（一）T淋巴细胞增殖(zngzh)试验,1.原理(yunl)：,淋巴细胞,DNA合成(hchng),分化,母细胞,刺激物,细胞变大,细胞浆扩大,空泡,核仁明显,核染色质疏松,第五页，共四十三页。,第六页，共四十三页。,2.淋巴细胞转化(zhunhu)的刺激物,非特异性刺激物：PHA-T细胞 ConA-T细胞 PWM-T、B细胞 LPS-B细胞特异性刺激物：异种(y zhn)抗原 同种组织抗原,第七页，共四十三页。,3.检测(jin c)方法,形态法：刺激物 淋巴细胞（4-6天）母细胞化 同位素法：PHA 淋巴细胞（54h）DNA合成期+3HTdR掺入 收集细胞(xbo)检测射线,测定(cd
3、ng)细胞内的3HTdR,第八页，共四十三页。,（1）形态学检查法,第九页，共四十三页。,方法学评价(pngji)：,优点：形态学方法简便易行，普通光学显微镜便能观察(gunch)结果，适于基层实验室应用。缺点：是依靠肉眼观察形态学变化，判断结果易受主观因素影响，重复性和准确性较差。,第十页，共四十三页。,（2）3H-TdR掺入法,第十一页，共四十三页。,优点：3H-TdR掺入法敏感性高，客观性强，重复性好。缺点：但需一定(ydng)设备条件，同时还存在放射性核素污染问题。,第十二页，共四十三页。,MTT,测吸光度(gungd),(3)MTT 比色法,第十三页，共四十三页。,(二)T细胞分泌功
4、能(gngnng)测定,体外培养的T细胞经各种丝裂原或抗原刺激后,分泌各种细胞因子,可借助免疫学、细胞生物学及分子生物学技术(jsh)分别检测细胞因子含量、生物学活性或基因表达水平，以反映T细胞功能。,第十四页，共四十三页。,（三）T细胞(xbo)介导的细胞(xbo)毒试验,1.原理(yunl)：,靶细胞抗原(kngyun),T细胞,观察杀伤活力,致敏CTL,靶细胞,第十五页，共四十三页。,形态学方法(fngf)：淋巴细胞+肿瘤细胞 计数残留肿瘤细胞,2.方法(fngf),意义(yy)：肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力,第十六页，共四十三页。,第十七页，共四十三页。,51Cr释放(shfng)
5、法,第十八页，共四十三页。,(四)体内(t ni)试验,特异性抗原皮肤(p f)试验PHA皮肤试验,第十九页，共四十三页。,二、B细胞功能(gngnng)检测,B细胞增殖能力的试验(shyn)溶血空斑试验B细胞抗体形成功能的检测体内试验,第二十页，共四十三页。,(一)B细胞(xbo)增殖能力的试验,抗IgM细菌(xjn)脂多糖SAC的SPA,B细胞(xbo)增殖,形态学,3HTdR掺入法,第二十一页，共四十三页。,(二)溶血(rn xu)空斑试验,1.原理(yunl)：,第二十二页，共四十三页。,2.方法学：,经典(jngdin)溶血空斑形成试验被动溶血空斑试验,第二十三页，共四十三页。,3临
6、床应用(yngyng)与评价,溶血空斑试验主要用于测定药物和手术等因素(yn s)对体液免疫功能的影响评价免疫治疗或免疫重建后机体产生抗体的能力。,第二十四页，共四十三页。,(三)B细胞(xbo)抗体形成功能的检测 酶联免疫斑点法ELISPOT,1.原理(yunl)：,第二十五页，共四十三页。,2应用(yngyng)与方法学评价：,该方法既可检测抗体分泌(fnm)细胞，又可检测抗体分泌(fnm)量。优点：稳定、特异、抗原用量少；可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌，并可定量；可检测组织切片中分泌抗体的单个细胞。,第二十六页，共四十三页。,(四)体内(t ni)试验,体内抗体产生的特异性抗原(k
7、ngyun)有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，分离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。,第二十七页，共四十三页。,染色(rns)计数,离心(lxn)取上清测LDH或AKP,离心(lxn)取沉淀测活细胞荧光,测发光强度,测CPM值,形态法酶释法荧光法同位素法化学发光法,三、NK细胞活性测定,靶细胞溶解,常用靶细胞:K562细胞株,第二十八页，共四十三页。,二 吞噬细胞功能检测(jin c)技术,按其形态大小分为两类：大吞噬细胞(tn sh x bo)单核-吞噬细胞系统小吞噬细
8、胞中性粒细胞,第二十九页，共四十三页。,一、中性粒细胞功能(gngnng)的检测,细胞趋化功能的检测 吞噬(tnsh)和杀菌功能的检测,第三十页，共四十三页。,(一)细胞运动功能(gngnng)趋化功能检测,1.原理(yunl)：,第三十一页，共四十三页。,2.方法(fngf)：,琼脂糖平板(pngbn)法,滤膜渗透法（Boyden 小室法）,第三十二页，共四十三页。,(二)吞噬和杀菌(sh jn)功能测定,1显微镜检查法：,第三十三页，共四十三页。,2.溶菌法,第三十四页，共四十三页。,NBT还原(hun yun)试验,原理(yunl)：,N-N-C+H+N=N-R-,N-NH2C N=NH
9、,四氮唑基（淡黄色）,甲臜（紫黑色）,3NBT还原(hun yun)试验,第三十五页，共四十三页。,中性(zhngxng)粒细胞,NBT,甲臜颗粒(kl)沉积于胞质中,第三十六页，共四十三页。,二、巨噬细胞功能(gngnng)检测,(一)炭粒廓清(kuqng)试验,正常小鼠肝中枯否细胞可吞噬清除90%炭粒，脾巨噬细胞约吞噬清除10%炭粒。据此给小鼠定量静脉注射印度墨汁(炭粒悬液)，间隔一定时间反复取静脉血，测定血中炭粒的浓度，根据血流中炭粒被廓清(kuqng)的速度，判断巨噬细胞的功能。,第三十七页，共四十三页。,(二)吞噬(tnsh)功能检测,巨噬细胞对颗粒性抗原(kngyun)物质具有很强
10、的吞噬功能，常用鸡红细胞(CRBC)、白色念珠菌、酵母细胞等作为吞噬颗粒，用斑蟊敷贴法收集人巨噬细胞或从腹腔渗出液获得鼠巨噬细胞。,第三十八页，共四十三页。,(三)巨噬细胞溶酶体酶的测定(cdng),1酸性磷酸酶的测定 硝酸铅法 偶氮法2非特异性酯酶的测定 常用(chn yn)-萘醋酸法,第三十九页，共四十三页。,(四)细胞毒作用(zuyng)测定,用IFN-激活(j hu)小鼠巨噬细胞，观察其对125I-UdR标记的DBA/2小鼠肥大细胞瘤P815的杀伤活性。,第四十页，共四十三页。,(五)巨噬细胞促凝血活性测定(cdng),激活的巨噬细胞可产生一种与膜结合的凝血活性因子，加速正常血浆(xu
11、jing)的凝固，为此取已经37预温的正常兔血浆和CaCl2混合液，加入经粘附有单层巨噬细胞的试管中，移置37，即时记录血浆凝固时间。,第四十一页，共四十三页。,Thanks！,第四十二页，共四十三页。,内容(nirng)总结,免疫细胞功能检测技术。淋巴细胞功能测定可分为体内实验和体外实验。T细胞（负责细胞免疫功能）。未转化和转化淋巴细胞的形态特征。PWM-T、B细胞。LPS-B细胞。肿瘤患者CTL杀伤肿瘤细胞的能力。可同时检测不同抗原诱导的不同抗体分泌(fnm)，并可定量。体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌菌苗等。常用靶细胞:K562细胞株。二 吞噬细胞功能检测技术。Thanks,第四十三页，共四十三页。,