1、核 农 学 报 2023，37（5）：09620970Journal of Nuclear Agricultural Sciences高能电子束辐照对杜仲叶品质的影响研究唐艺文1 陈谦2，3 王钢1 付孟1 黄敏2，3，*王丹1 高鹏2，3（1西南科技大学，四川 绵阳 621010；2四川省原子能研究院，四川 成都 610101；3辐照保藏四川省重点实验室，四川 成都 610101）摘要：为探究高能电子束辐照对川产道地中药材杜仲叶品质的影响，本试验研究了不同辐照剂量（0、2、4、6、8 kGy）的高能电子束辐照对杜仲叶中的微生物含量、活性物质含量、高效液相色谱（HPLC）指纹图谱、色泽、水分和
2、浸出物含量的影响。结果显示，电子束辐照能有效降低杜仲叶中需氧菌、霉菌和酵母菌总数；HPLC分析结果表明，不同辐照剂量对杜仲叶中的活性成分绿原酸、芦丁的影响不大，其含量变化与辐照剂量均无极显著线性相关性（P0.01）；此外，不同电子束辐照剂量处理的杜仲叶指纹图谱相似度均大于0.90；随着辐照剂量的增加，杜仲叶色泽呈现先变浅再变深的变化，主要表现为a*、b*值先减小后增大；各辐照剂量下杜仲叶的水分、醇溶性浸出物含量均符合2020年版 中华人民共和国药典 规定。同时，2 kGy剂量的电子束辐照能有效降低杜仲叶微生物数量，且对活性成分含量和指纹图谱无显著影响。综上，2 kGy的电子束辐照剂量既能使杜仲
3、叶微生物数量明显降低，又能够保障其品质。本研究结果为电子束辐照技术在杜仲叶贮藏中的应用提供了一定的参考依据。关键词：电子束辐照；杜仲叶；微生物含量；指纹图谱；有效成分DOI：10.11869/j.issn.1000-8551.2023.05.0962杜仲（Eucommia ulmoides Oliv.）为杜仲科杜仲属多年生落叶乔木。传统中药以杜仲树皮入药，经学者研究发现杜仲叶和杜仲树皮具有相似的活性成分1，二者均具有补肝益肾、强筋健骨、安胎等功效2。杜仲叶是杜仲的干燥叶片，早被 中华人民共和国药典（2005版）收载入药 3。同时，杜仲叶作为一种药食同源物质，具有良好的保健功能4，其含有的绿原酸
4、具有抗高血压和降血脂作用5-7，芦丁具有较强的降压和舒张血管作用 8-9。作为我国的特有品种，杜仲在我国的种植面积占世界总种植面积的99%以上 10，主要分布于四川、陕西、湖北等地；同时，在国际市场上，杜仲也是被许多国家认可的中药材品种，2019年我国杜仲出口量达1 084.6 t，其健康价值倍受国际广泛好评10。相关数据显示，种植1亩杜仲的纯收入可达3 500元以上11，经济效益良好。同时，原国家林业局发布了相关文件，标志着杜仲产业进入国家整体统筹战略层面11。四川省制定了2025年中药材产业发展目标：中药材种植面积达850万亩、年总产值达300亿元以上12。杜仲作为川产道地药材之一13，具
5、有良好的发展空间。目前，除了传统用于药用成分提取、生产杜仲胶外，作为药食同源的杜仲在保健食品、饮料等领域也已打开局面11。中药材在其储藏过程中易发生腐败、虫蛀、霉变等现象14，会造成药材的药效降低，储藏时间缩短等不良影响。传统中药材的贮藏养护方法存在许多潜在问题与安全隐患，正逐步被市场及政府所规范或淘汰。同时，加强中药材质量控制、大力推动中药质量提升是国家关注的重点工作内容15。需要新的贮藏养护方法满足当前需求，因此研发适合中药材储藏的新技术是当前研究的热点内容。辐照灭菌技术是一种利用放射源产生的射线、加速器产生的高能电子束和X射线辐照农产品、食品等，达到抑制发芽、推迟成熟、杀虫灭菌和改进品质
6、等作用的技术16-17。相较于传统的灭菌技术，辐照灭菌是一种绿色、安全、卫生、经济、高效的“冷杀菌技术”，在食品、农产品的贮藏中已得到广泛应用18-23。中华人民共和国药典 将辐照技术作为灭菌的一种处理手段，可用于不受辐射破坏的原料药及成品等的灭菌24。其中高能电子束辐照技术除具有60Co-辐照技术相应的文章编号：1000-8551（2023）05-0962-09收稿日期：2022-05-23 接受日期：2022-11-18基金项目：四川省重大科技专项项目（2019ZDZX0003），四川省科技创新人才项目（2021JDRC0042），四川省苗子工程项目（2021JDRC0121），四川省区域
7、创新合作项目（2022YFQ0044）作者简介：唐艺文，女，主要从事辐照加工与辐照工艺研究。E-mail：*通讯作者：黄敏，女，研究员，主要从事辐照食品研究。E-mail：9625 期高能电子束辐照对杜仲叶品质的影响研究优势外，还具有操作简便、处理效率高、无放射源衰减、安全性更高等优点，与当前中药材贮藏养护的需求相切合25。辐照技术在中药及中药制品的灭菌和加工上已有相关研究报告，何毅等26研究发现，2 kGy剂量电子束辐照能有效降低麦冬中微生物数量，对其色泽、风味品质、活性成分含量及抗氧化活性无显著影响；徐光临等27研究发现，黄岑和南星经60Co-射线辐照后灭菌效果理想，且25 kGy辐照对黄
8、芩和南星有效成分无影响；蔡汶莉28研究发现，高能电子束辐照能够有效杀灭百合和山银花药材中的微生物，对药材品质的影响也较小。可见，辐照技术可在达到灭菌效果的同时，保证药材药效。目前，辐照技术在杜仲叶贮藏加工中的研究较少，梁倩等 29 发现经不同剂量60Co-射线辐照后，杜仲等中药材电子自旋共振（electron paramagnetic resonance，ESR）波谱峰信号强度与吸收剂量均呈二次项关系增长，即辐照产生的自由基含量随着吸收剂量的增加而增加，但未对其品质进行整体探究。本研究以杜仲叶为研究对象，通过测定不同剂量辐照前后其水分、浸出物、微生物总量、绿原酸含量、芦丁含量、指纹图谱相似度来
9、综合评价电子束辐照对杜仲叶品质的影响，旨在为电子束辐照加工技术在杜仲叶贮藏应用中的质量控制提供参考依据。1材料与方法1.1材料与试剂杜仲叶，购于四川省中兴药业有限公司；绿原酸对照品（98%）、芦丁对照品（98%），购于成都埃法生物科技有限公司；胰酪大豆胨琼脂培养基、沙氏葡萄糖琼脂培养基，购于北京奥博星生物技术有限责任公司；甲醇、磷酸等色谱纯试剂，购于赛默飞世尔科技（中国）有限公司；无水乙醇等分析纯试剂，购于成都市科隆化学品有限公司。1.2仪器与设备UltiMate 3000双三元、二维液相色谱仪系统，美国赛默飞世尔科技有限公司；RHCX-350超声波清洗仪，济宁荣汇超声波设备有限公司；GE60
10、DA高压蒸汽灭菌锅，美国致微公司；NH300色差仪，深圳市三恩时科技有限公司。1.3试验方法1.3.1 辐照剂量选择 为确保中药的安全、有效、质量稳定，根据“中药辐照灭菌技术指导原则”（2015年第86号）30，确定拟采用的最大辐照剂量不超过10 kGy。本试验设置2、4、6、8 kGy 4个剂量组和CK（0 kGy）对照组。1.3.2 药材处理 杜仲叶采用复合材料真空包装（20 cm30 cm，30丝）密封，每袋50 g，每个剂量各3袋，送至重庆恒德辐照技术有限公司采用高能电子加速器（电子束能量 10 MeV，功率 20 kW）进行辐照处理，辐照剂量设定为 2、4、6、8 kGy，以未辐照样
11、品为对照（CK），经重铬酸银剂量计测定样品的实际吸收剂量分别为2.15、4.05、6.88、8.62 kGy，下文均以设定剂量进行表示。杜仲叶辐照后进行粉碎，过65目筛。1.3.3 微生物含量测定 测定辐照前后杜仲叶中的需氧菌总数、霉菌和酵母菌总数。参照2020年版 中华人民共和国药典 四部通则1105非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法24。1.3.4高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）测定活性成分含量和指纹图谱1.3.4.1 对照品溶液 精密称取绿原酸标品，加入甲醇，配置成浓度为0.22 mgmL-1的溶液，即得。精密称取
12、芦丁标品，加入甲醇，配置成浓度为0.093 mgmL-1的溶液，即得。1.3.4.2 供试品溶液的制备 精密称取各剂量样品粉末0.5 g，加入10 mL甲醇，称重，室温下超声提取40 min，取出，冷却，称重，用甲醇补足重量，过滤，取滤液，得供试品溶液；各辐照剂量制备3个平行。1.3.4.3 色谱条件 色谱柱：Hyersil GOLD（250 mm4.6 mm，5 m），流动相：以0.1%磷酸溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按表1进行梯度洗脱；流速：0.8 mLmin-1；柱温：30；进样体积：10 L。绿原酸的检测波长为327 nm，芦丁的检测波长为 208 nm，指纹图谱检测波长208 n
13、m。1.3.4.4 含量测定 设置待测液进样量10 L进行液相色谱仪测定，并采用外标法计算样品中绿原酸与芦丁的含量。1.3.4.5 指纹图谱采集 按上述方法制备对照品和供试品溶液，设置进样量10 L、检测波长208 nm进行表1流动相时间程序Table 1The time program of mobile phase时间Time/min0.027.029.036.038.046.00.1%磷酸0.1%acetic acid solution/%95.076.110.010.095.095.0乙腈Acetonitrile/%5.023.990.090.05.05.0963核农学报37 卷 测定
14、，得到杜仲叶的HPLC指纹图谱。1.3.5色泽测定参照吕绪桢等31的方法，通过色差仪测定杜仲叶样品的色泽，记录亮度值L*值、红绿值a*值、黄蓝值b*值，按照公式计算饱和度C和总色差E：C=a*2+b*2（1）E=L*2+a*2+b*2（2）。1.3.6水分、浸出物含量测定杜仲叶水分和浸出物含量参照2020版 中华人民共和国药典 中的方法进行测定24。1.4数据处理采用SPSS 22.0软件对3次重复试验所得数据进行显著性分析和相关性分析；采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统2012版进行HPLC指纹图谱分析。2结果与分析2.1电子束辐照对杜仲叶药材微生物数量的影响根据2020年版 中华人民共和国
15、药典 规定 24：非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准为需氧菌总数不超过103 CFUg-1，霉菌和酵母菌总数不超过102 CFUg-1，对控制菌未做统一规定。由微生物测定结果（表2）可知，未经辐照的杜仲叶样品中微生物数量大于限量标准，不符合药典要求。当电子束辐照剂量达到2 kGy时，杜仲叶的微生物数量下降至药典中所规定的非无菌药用原料及辅料的微生物限量标准，并且辐照剂量越大，杜仲叶中微生物数量越少，当辐照剂量为4 kGy时，微生物数量均降低至检测限（10 CFUg-1）以下。2.2电子束辐照对杜仲叶药材中活性物质含量的影响绿原酸和芦丁是杜仲叶主要活性成分，其含量是评价杜仲叶品质的重要指标。由
16、表3可知，辐照前后杜仲叶中绿原酸含量在0.21%0.28%之间，均大于0.080%，符合2020年版 中华人民共和国药典 要求 24。辐照前后杜仲叶中芦丁含量在0.07%0.09%之间，波动较小。与CK相比，2、4、6 kGy剂量电子束辐照处理后样品中绿原酸和芦丁含量显著增加（P0.05）。相关性分析发现（表4），绿原酸、芦丁含量与辐照剂量之间呈负相关，但相关性不显著（P0.01）。2.3电子束辐照对杜仲叶指纹图谱的影响采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统（2012版）对不同辐照剂量电子束辐照处理杜仲叶的HPLC图谱进行数据分析，以未辐照（CK）杜仲叶作为参照图谱，进行多点校正、自动匹配（时间窗宽度为0.01），标定16个共有峰作为杜仲叶的特征峰，生成对照图谱R，见图1。其中7号峰为绿原酸，11号峰为芦丁。将经不同辐照剂量电子束辐照处理杜仲叶的指纹图谱与对照图谱进行比较，计算得到与对照指纹图谱的相似度，结果见表5。以7号峰绿原酸为参比峰（设定其相对保留时间和相表2电子束辐照处理对杜仲叶微生物总数的影响Table 2Effect of electron-beam irradiation o