1、GB/T17480-20084.1.11底物溶液b:1LpH5.0乙酸钠-柠檬酸缓冲液中加入0.3%过氧化氢溶液28mL,。4.1.12终止液：硫酸溶液，c(H,S0)=2mol/L。4.2甲醇水溶液：5mL甲醇加5mL水混合。4.3测试盒中试剂的配制4.3.1酶标黄曲霉毒素B,抗原溶液：在酶标黄曲霉毒素B,抗原(4.1.4)中加入1.5mL酶标黄曲霉毒素B,抗原稀释液(4.1.6)，配成试验用酶标黄曲毒毒素B,抗原溶液，冰箱中保存。4.3.2洗涤液：洗涤母液(4.1.8)中加300mL蒸馏水配成试验用洗涤液。5仪器和设备5.1小型粉碎机。5.2分样筛：孔径1.00mm.5.3分析天平：感量0
2、.01g。5.4滤纸：快速定性滤纸，直径9cm10cm,5.5具塞三角瓶：100mL。5.6电动振荡器。5.7微量连续可调取液器及配套吸头：10L100L。5.8恒温培养箱。5.9酶标测定仪：内置450nm滤光片。6分析步骤6.1试样制备按GB/T20195要求制备试样。试样需通过孔径1.00mm的分样筛。如果样品脂肪含量超过10%，在粉碎之前用石油醚脱脂。在这种情况下，分析结果以未脱脂样品质量计。6.2试样提取6.2.1称取5g试样(6.1)，精确至0.01g,置于100mL具塞三角瓶(5.5)中，加人甲醇水溶液(4.2)25mL,加塞振荡10mn,过滤，弃去1/4初滤液，再收集适量试样液。
3、如果样品中离子浓度高，建议按照附录A的规定对试样滤液进行萃取。6.2.2根据各种饲料中黄曲毒毒素B1的限量规定和黄出霉毒索B,标准溶液(4.1,3)浓度，用样品稀释液(4,1,2)将试样液(6.2.1)适当稀释，制成待测试样稀释液。如果黄曲霉毒素B,标准溶液浓度为1.00g/L时，建议按照附录B的规定稀释试样。6.3限量测定6.3.1试剂平衡：将测试盒(4.1)于室温中放置约15min,平衡至室温。6.3.2测定：在微量反应板(4.1.1)上选一孔，加入50L样品稀释液(4.1.2)、50L酶标黄曲霉毒素B,抗原稀释液(4.1.6)，作为空白孔：根据需要，在微量反应板(4.1.1)上选取适量的
4、孔，每孔依次加入50L黄曲霉毒素B,标准溶液(4.1.3)或试样液(6.2.2)。再每孔加人50L酶标黄曲霉毒素B,抗原溶液(4.3.1)，在振荡器(5.6)上混合均匀。放在37恒温培养箱(5.8)中反应30min。将反应板从培养箱中取出，用力甩干，加250L洗涤液(4.3.2)洗板4次，洗涤液不得溢出，每次间隔2mn,甩掉洗涤液，在吸水纸上拍千。每孔各加入50L底物溶液a(4.1.10)和50L底物溶液b(4.1.11)。摇匀。在37恒温培养箱(5.8)中反应15min。每孔加50L终止液(4.1.12)，在显色后30min内测定。6.3.3结果判定6.3.3,1目测法：比较试样液孔与标准溶
5、液孔的颜色，若试样液孔颜色比标准溶液孔浅者，为黄曲霉毒2GB/T17480-2008素B1含量超标：若相当或深者为合格。6.3.3.2仪器法：用酶标测定仪(5.9)，在450m处用空白孔调零点，测定标准溶液孔及试样液孔吸光度A值，若A试瓶小于A标在溶成孔，为黄曲霉毒素B含量超标：若A试样依大于或等于A标准溶森孔，为合格。6.3.3.3若试样液中黄曲霉毒素B,含量超标，则根据试样液的稀释倍数，计算黄曲霉毒素B,的含量。6.4定量测定若试样中黄曲霉毒素B,的含量超标，则用酶标测定仪(5.9)在450m波长处进行定量测定，通过绘制黄曲霉毒素B,的标准曲线来确定试样中黄曲霉毒素B,的含量。用样品稀释液
6、(4.1.2)将50.0g/L黄曲霉毒素B标准溶液(4.1.3)稀释成0.0g/L、0.1g/L、1.0gL、10.0gL、20.04g/L、50.0g/L的标准工作溶液，按限量法测定步骤测得相应的吸光度值A。以0,02g九黄曲霉毒素B,标准工作溶液的吸光度值A,为分母，其他浓度标准工作溶液的吸光度值A为分子的比值，再乘以100为纵坐标，对应的黄曲霉毒素B,标准工作溶液浓度的常用对数值为横坐标绘制标准曲线。根据试样A/A。1O0的值在标准曲线上查得对应的黄曲霉毒素B,的含量。试样中黄曲霉毒素B,的含量以质量分数X计，单位以微克每千克(g/kg)表示，按式(1)计算。X=exvXn式中：p一从标准曲线上查得的试样提取液中黄曲霉毒素B含量，单位为微克每升(g/L):V一试样提取液体积，单位为毫升(mL):一试样稀释倍数：一试样的质量，单位为克(g)。计算结果保留2位有效数字，7精密度重复测定结果的相对偏差不得超过10%。