1、研究报告 年第 卷第 期（总第 期）：引用格式：朱祎一，文安燕，王琴，等 贵州望谟板栗冷藏期致腐真菌鉴定及其生物学特性研究 食品与发酵工业，（）：，（）：贵州望谟板栗冷藏期致腐真菌鉴定及其生物学特性研究朱祎一，文安燕，王琴，胡悦，秦礼康（贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵州 贵阳，）摘 要 板栗腐烂由多种真菌协同侵染造成，尤其冷藏期栗果腐烂率可达。该研究以贵州望谟主产区板栗为实验对象，对其冷藏期进行致腐真菌分离纯化、柯赫氏法则致腐性测定、形态学和分子生物学鉴定。结果表明，分离鉴定出的 株致腐真菌分别为层出镰刀菌（）、皮落青霉（）和链格孢菌（）。生物学特性试验表明，层出镰刀菌菌丝生长和产孢最适 值
2、分别为 和，最适菌丝生长和产孢碳源为乳糖，氮源为甘氨酸，温度为，光照条件为 黑暗；皮落青霉菌丝生长最适碳源为乳糖、值为 ，最利于产孢的碳源为大豆多糖、值为 ，菌丝生长和产孢最适温度为 、氮源为尿素、光照条件为 黑暗；链格孢菌分别以蔗糖、麦芽糖为碳源时菌丝生长最快、产孢量最大，菌丝生长和产孢最适温度为 、氮源为蛋白胨、值为 、光照条件为 黑暗。贵州望谟板栗冷藏期主要致腐真菌的确定，可为板栗腐烂有效防控及致腐机制研究提供科学依据。关键词 板栗；致腐菌；菌株鉴定；生物学特性第一作者：硕士研究生（秦礼康教授为通信作者，：）基金项目：贵州省科技计划重点项目（黔科合支撑重点 号）收稿日期：，改回日期：粮食
3、安全是“国之大者”，而发展木本粮油产业是缓解我国粮油供需矛盾、维护国家粮油安全的必然选择。板栗（），属被子植物门，双子叶植物纲，壳斗科栗属多年生落叶植物，包括 个属和大约 个种，在亚洲、美洲、非洲以及欧洲广泛分布。根据粮农组织统计，我国板栗种植面积和产量均居世界首位，素有“木本粮食”之美称。望谟板栗因其果实大，富含优质碳水化合物、蛋白质、维生素和矿物质等多种营养物质，而获国家地理标识产品认证。同时，望谟板栗作为贵州省望谟县“一县一业”的主导产业，每年为 户栗农带来 亿元经济收入，是巩固拓展脱贫攻坚和助力乡村振兴的支柱产业。我国板栗每年因贮藏不当而造成的损失达年总产量的，经济损失上亿元。目前，板
4、栗贮藏方法有可食用涂膜贮藏、辐照贮藏、臭氧贮藏和冷藏等，其中冷藏是保鲜效果较为理想的方法之一。然而，板栗果质特殊，收获后的栗果水分含量高、代谢快，在冷藏过程中极易受到致腐微生物的侵染。致腐真菌侵染是导致板栗腐烂的重要原因之一，细菌导致板栗腐烂的报道较少，如研究发现泡囊假单胞杆菌能够导致板栗腐烂，其生物学特性与腐烂病害的发生和流行规律有着密切联系。腐烂后的板栗常伴有苦味和霉酸味，后期逐渐干枯甚至形成空洞，导致其品质劣变、风味损失，从而失去食用价值。这不仅浪费板栗资源，还会对人体健康造成一定危害，严重制约着我国板栗行业的发展。目前从腐烂板栗中分离获得的致腐真菌包括镰孢菌属、青霉菌属、链格孢属、毛霉
5、属、聚端孢属和壳梭孢属等。梁丽松等在 个主要板栗产区的 个产区板栗中都分离出了镰孢菌属的致腐菌，说明镰孢菌属引起板栗腐烂的现象是普遍存在的；王海霞等以北京怀柔的腐烂板栗为原料，从 个属真菌中确立链格孢属、镰刀菌属、聚端孢属和壳梭孢属为优势致腐真菌；等从武汉低温冷藏的腐烂板栗中确立优势致腐真菌为青霉属、根霉属、链格孢属和曲霉属。板栗因品种、种植环境和贮藏条件等因素不同，导致其致腐菌差异较大，且至今尚未见望谟板栗致腐微生物的报道。因此，为明确望谟板栗冷藏期腐烂栗果的致腐菌，本研究展开了板栗致腐菌的分离纯化、致腐性验证、形态学观察和分子生物学鉴定，并分析其生物学特性，以期为深入研究其致腐机制和有效调
6、控板栗冷藏的方式与条件提供理论依据。食品与发酵工业 （）材料与方法 材料与仪器板栗采自贵州光秀生态食品有限责任公司冷库，产地为贵州省望谟县，冷库温度为 ，每周喷洒次蒸馏水保湿。采样过程用无菌采样袋装样后立即放入装有冰袋的泡沫箱中运回实验室冷库，冷藏条件与公司相同。实验中所有真菌的培养均使用马铃薯琼脂葡萄糖（，）培养基。高压灭菌锅，上海申安医疗机械厂；生化培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司；优纯超纯水机，济南飞蓝水处理设备有限公司；超净工作台，浙江苏净净化设备有限公司。致腐菌的分离与纯化板栗致腐菌的分离纯化采用组织分离法。选取自然腐烂板栗，在无菌操作台中剥去栗壳，用已灭菌的手术刀在栗果病健交界处切
7、 组织块，于乙醇中浸泡，无菌水冲洗 次，用滤纸吸干表面水分，再用已灭菌的镊子将组织块放入 平板中，每个平板放 块。将平板放入 恒温培养箱中培养，待菌落长出后，根据其颜色、形态、大小等表型差异，挑取不同形态、颜色的菌落进行纯化培养。致腐菌的形态学鉴定将致腐菌在 平板上 培养 ，根据菌落形态、色泽、生长速度以及在光学显微镜下的菌丝及孢子形态等特征，对致腐菌进行初步形态学鉴定。具体方法如下：于载玻片上滴加乳酸酚棉蓝染色液，用接种环挑取边缘处菌丝置于染色液中，盖片，用滤纸吸去盖玻片周围溢出的液体，烤片直至染色液轻微沸腾为止，置于显微镜先低倍后高倍镜检。致腐性鉴定采用针刺法和菌饼接种法。剔除病果、虫果及
8、裂果，选取健康板栗用乙醇浸泡消毒 ，无菌水冲洗 次，在超净工作台中轻轻风干栗壳表面水分，剥去板栗顶芽处的外壳和种皮，用针轻刺栗仁接种部位，取 活化后的菌丝块接种于伤口表面，保鲜膜固定，以脱脂棉沾无菌水为对照，于培养皿中 恒温保湿培养。后去掉菌饼，对腐烂栗果的致腐菌再次进行分离纯化，与原接种菌进行比较。致腐菌的分子生物学鉴定从培养 的菌株上挑取适量菌丝，放入 的灭菌离心管中，用研磨机将其磨碎，按照 基因组试剂盒（生工生物工程上海有限公司）说明书提取。采用引物 （）和 （）对致腐菌基因进行 扩增，反应总体积 ，其中上下引物各 ，模板，。扩增程序：预变性 ，变性 ，退火 ，延伸 ，共 个循环，修复延
9、伸 ，保存。产物用 琼脂糖电泳检测，合格后送往生工（上海）公司测序。测序结果通过 中的 进行同源性比对，用 软件构建系统发育树。致腐菌的生物学特性研究取出 保存的菌株接种于 平板上，于 生化培养箱活化 后备用。不同碳源对菌丝生长和产孢量的影响以 为基础培养基，分别添加 的蔗糖、大豆多糖、麦芽糖、乳糖和可溶性淀粉置换 中葡萄糖，得到不同碳源培养基。将直径为 的致腐菌菌饼分别接种于不同碳源培养基，次重复，全暗条件下 恒温培养 后，采用十字交叉法测量菌落直径。于每个平板中加入 无菌水，制成孢子悬浮液，使用血球计数板测定每毫升孢子悬浮液中孢子总数。不同氮源对菌丝生长和产孢量的影响以 为基础培养基，分别
10、添加 的蛋白胨、牛肉膏、硫酸铵、甘氨酸和尿素制备不同氮源培养基。培养条件、菌丝生长和产孢量测定方法同。不同温度对菌丝生长和产孢量的影响将 直径的致腐菌菌饼接种于 平板，置于、全暗培养 ，次重复。菌丝生长和产孢量测定方法同 。不同光照对菌丝生长和产孢量的影响将 直径的致腐菌菌饼接种于 平板，置于光照（）、光暗交替（）、黑暗（）的 恒温培养箱中培养 ，次重复。菌丝生长和产孢量测定方法同 。不同 对菌丝生长和产孢量的影响在无菌操作台中用 和 将 培养基的 值分别调至 、和，将直径为 的菌饼接种于 平板中央，全暗条件下 恒温培养 ，研究报告 年第 卷第 期（总第 期）次重复。菌丝生长和产孢量测定方法同
11、 。数据处理 和 进行数据处理和分析。结果与分析 分离纯化结果从腐烂栗果中共分离出 株真菌，经致腐性验证获得 株致腐性较强且满足柯赫氏法则的真菌，致腐率分别为、和 ，选取致腐率为 的 株菌分别命名为、和。分离菌株的菌落及形态特征根据菌落特征、菌丝和孢子形态等对 株菌进行初步形态学鉴定，培养 后其菌落特征与显微结构如图 所示。菌丝呈棉絮状，边缘菌丝较稀薄，生长速度快。菌落正面呈白色，背面为橙黄色，能产生小型分生孢子，孢子呈长椭圆形，具有隔膜，表面光滑，分生孢子梗具分枝。菌落中心有脐状突起，其他部分有放射状条纹、质地绒状，菌落边缘兼有粉粒状，生长速度较慢。菌落正面边缘为白色，中部灰绿色，背面初期为
12、黄色，后期为黄褐色。分生孢子大量产生，由蓝绿色转变至黄绿色，孢子呈现球形，较平滑，分生孢子梗呈扫帚状，排列紧密。菌落呈絮状，圆形，生长迅速。菌落正背面同色，但正面颜色略深于背面，初期呈黄褐色，后期呈棕褐色。菌丝及分生孢子梗为褐绿色，分生孢子倒棒状，表面具横隔和纵隔，成壁砖状结构，横隔较粗，末端喙短，排成较长的直 链 或 斜 链，大 小较一致。；图 、的菌落形态特征 ，致腐性鉴定利用针刺法和菌饼接种法对板栗进行致腐性验证，接种致腐菌 后板栗腐烂情况见图。健康板栗接种 菌株 后开始腐烂，初期病斑呈浅褐色，外缘处有黑色晕圈，中期腐烂程度加剧，病斑扩大且颜色逐渐加深至深褐色，湿度大时会出现白色或浅紫色
13、菌丝体，有异味并分泌黏状物。深褐色湿腐，组织湿润松散，后期病斑不断扩大，腐烂程度不断加剧直至板栗完全腐烂。健康板栗接种 菌株 后开始腐烂，初期病斑为深褐色，外缘处有淡黄色晕圈，中期病斑逐渐扩大，产生大量灰绿色孢子。深褐色干腐，组织干燥紧实，后期腐烂程度仍会加剧，但病斑无扩大现象。健康板栗接种 菌株 后开始腐烂，初期病斑呈黑色，中期腐烂程度加剧，病斑不断扩大且颜色不断加深至黑灰色，菌丝体为黑色。黑灰色干腐，组织干燥紧实，后期腐烂程度仍会加剧，但病斑无扩大现象。对照组无腐烂现象。分子生物学鉴定以菌株、和 的基因组 为模板，以 引物进行 扩增，、分别获得、条带，扩增产物测序后与 进行比对，利用 软件
14、进行系统发育树绘制（图）。经比对发现，与层出镰刀菌（）处于同一分支，同源性达；与皮落青霉（）食品与发酵工业 （）处于同一分支，同源性达；与链格孢菌（）处于同一分支，同源性达。因此，将、和 分别鉴定为层出镰刀菌、皮落青霉和链格孢菌。生物学特性研究 碳源对菌丝生长和产孢量的影响 株菌对不同碳源的利用情况见图。最适宜 菌丝生长和产孢的碳源为乳糖，其次是蔗糖，而菌丝生长利用率最低的是大豆多糖，在产孢量上对大豆多糖、麦芽糖和可溶性淀粉的利用率差异不显著，研究表明百合枯萎病病原菌最适生长和产孢碳源分别为蔗糖和乳糖。菌丝生长的最适碳源为乳糖，其他碳源处理对菌丝生长的影响区别不大，产孢的最适碳源是大豆多糖，且
15、产孢量显著高于其他处理（）。最利于 菌丝生长和产孢的碳源分别是蔗糖、麦芽糖，其次是乳糖，不同碳源对 产孢量的影响差异显著（），有研究表明链格孢菌菌丝生长和产孢的最适碳源为蔗糖和葡萄糖。这可能是由于以麦芽糖为碳源作为附加添加剂应用于固体培养基时，链格孢菌筛选出最高的糖化酶效价，可将麦芽糖水解为葡萄糖。；对照组图 致腐性鉴定 图 、的系统发育树 ，；图 碳源对菌丝生长和产孢量的影响 注：不同小写字母代表差异显著（）（下同）氮源对菌丝生长和产孢量的影响致腐菌对不同氮源的利用情况如图 所示。以甘氨酸为氮源时，菌丝生长最快且产孢量最大，与其他氮源相比差异较为显著，推测甘氨酸为层出镰刀菌生长的最适氮源，与
16、翟雅鑫等报道的层出镰刀菌产孢的最适氮源为甘氨酸结论一致。菌丝生长的最适氮源为尿素和甘氨酸，菌株产孢的最适氮源为尿素且产孢量与其他氮源具有显著差异（）。菌丝生长和产孢的最适氮源为蛋白胨，其次为甘氨酸，以尿素为氮源时菌丝生长最慢且产孢量最低。王俊凤、赵艳琴等、刘行风等研究表明链格孢菌菌丝生长和产孢的最适氮源为蛋白胨，可初步判定蛋白胨是适宜链格孢菌生长和产孢的氮源。由于望谟板栗中富含蛋白质，其中以天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、亮氨酸和甘氨酸为主，故 株致腐菌菌丝生长对甘氨酸利用率较高，说明 种致腐菌对氮源的利用情况存在相似性，因此能够同时引起板栗腐烂。研究报告 年第 卷第 期（总第 期）；图 氮源对菌丝生长和产孢量的影响 温度对菌丝生长和产孢量的影响不同温度对、和 菌丝生长和产孢的影响具有一定差异（图）。在 均能生长和产孢，菌丝生长速度和产孢量在 与温度呈正相关，呈负相关，高于 时停止生长和产孢，大量研究表明，层出镰刀菌菌丝生长和产孢的最适温度为 ，故基本确定层出镰刀菌在 左右最适宜生长和产孢。菌丝生长及产孢的温度范围为 ，菌丝生长和产孢的最适温度为，超过 停止生长和产孢。在 时菌丝生长最快且产