1、安徽农学通报2023年05期动植物 微生物 食用菌 中药材黑木耳黑色素的液体发酵培养及提取工艺研究王小漫柴新义于士军向玉勇孙星（滁州学院生物与食品工程学院，安徽滁州 239000）摘要为提高黑木耳黑色素的产量，以碱溶酸沉法对黑木耳液体发酵菌丝体中的黑色素进行提取，以黑色素得率为指标，采用单因素试验和正交设计试验，对黑木耳黑色素的液体发酵生产及提取工艺条件进行了研究。结果表明，黑木耳黑色素的最优液体发酵生产工艺条件为起始pH 5.5、25、培养9 d；最佳提取工艺条件为NaOH浓度2 mol/L、料液比1 40、浸提1.5 h。黑木耳黑色素得率可达1.55%。研究结果可为黑木耳工业化液体发酵生产
2、黑色素提供重要的参考。关键词黑木耳黑色素；液体发酵；黑色素得率；工艺条件优化中图分类号Q939.96文献标识号A文章编号1007-7731（2023）05-0031-06Study on Liquid Fermentation Culture and Extraction Technology of Melanin fromAuricularia auriculataWANG Xiaoman CHAI Xinyi YU Shijuan XIANG Yuyong SUN Xing（School of Biology and Food Engineering,Chuzhou University,
3、Chuzhou Anhui 239000）AbstractIn order to improve the yield of Auricularia auricula melanin,the melanin in liquid fermentationmycelium of Auricularia auricula was extracted by alkali solution and acid precipitation.Taking the yield of melanin asthe index,the liquid fermentation production and extract
4、ion conditions of Auricularia auricula melanin were studied bysingle factor test and orthogonal design test.The results showed that the optimum liquid fermentation conditions ofAuricularia auricula melanin were as follows:initial pH 5.5,25 and culture for 9 days;The optimum extractionconditions were
5、 NaOH concentration of 2 mol/L,solid-liquid ratio of 1 40 and extraction for 1.5 h.The yield of melaninfrom Auricularia auricula can reach 1.55%.The results can provide an important reference for the industrial liquidfermentation of Auricularia auricula to produce melanin.KeywordsAuricularia auricul
6、a melanin;liquid fermentation;melanin yield;optimization of process conditions黑木耳（Auricularia auricula）隶属担子菌亚门（Basidiomycotina）、层菌纲（Hymenomycetes）、木耳目（Auriculariales）、木耳科（Auriculariaceae）、木耳属（Auricularia），在我国云南、东北、河南等多地广泛分布1。黑木耳中富含蛋白质、多糖、氨基酸、黑色素、黄酮、多酚等多种生物活性化合物，兼有优良的食用与药用价值2。其中，黑色素是黑木耳最主要的活性物质之一，黑木耳
7、子实体呈现黑褐色就是其富含黑色素的缘故3。黑色素是一种氨基酸衍生物，是由多羟基酚类或吲哚类物质氧化聚合而成的大分子疏水性生物聚合体4。黑木耳黑色素的安全性高，且具有抗辐射、抗氧化、清除自由基与提高免疫力等多方面的生理功能，是极具发展潜力的天然功能性色素5-9。黑木耳的传统栽培是采用固体菌种进行接代转接，每一代都需要经过6090 d的栽培，周期较长，同时由于环境等不可控因素会导致栽培过程中容易出现菌龄不一致、污染率高以及生产效率低下等问题。微生物深层液体发酵生产技术的逐步成熟，因其具有周期短、成本低、便于分离纯化等优势而引起广泛关注10-11。已有研究表明，深层液体发酵的黑木耳在营基金项目安徽省
8、科技厅科技成果转移转化乡村振兴科技项目（202107d06020018）；安徽省高等学校本科质量工程项目（2020jyxm1322、2020 xsxxkc314）；滁州学院开放实验项目（kfsy2130）。收稿日期2022-05-08-31DOI:10.16377/ki.issn1007-7731.2023.05.021安徽农学通报2023年05期动植物 微生物 食用菌 中药材养价值以及生理活性方面并不比传统栽培技术获得的黑木耳低，其中液体发酵的成分含量甚至高于黑木耳子实体中的含量12-15。鉴于此，为提高黑木耳黑色素的产量，本研究以碱溶酸沉法对黑木耳液体发酵菌丝体中的黑色素进行提取，以黑色素
9、得率为指标，采用单因素试验和正交设计试验，对黑木耳黑色素的液体发酵生产及提取工艺条件进行了研究，以期为黑木耳黑色素的工业化生产提供参考。1材料与方法1.1材料1.1.1供试菌种。本试验使用黑木耳109菌种，购自山东耀胜生物科技有限公司。1.1.2试验试剂。PDA培养基（南通凯恒生物科技有限公司）；葡萄糖（天津市汇杭化工有限公司）、酵母膏（杭州百思生物技术有限公司）、MgSO47H2O（上海强顺化工有限公司）、KH2PO4（天津市致远化学试剂有限公司）、HCl、NaOH（上海振企化学试剂有限公司）等均为分析纯。1.1.3仪器设备。高压蒸汽灭菌锅（BXM-30R型立式压力蒸汽灭菌锅）；超净工作台（
10、SW-CJ-1BU，苏州新区枫桥净化设备厂）；高速离心机（H2-16K，湖南可成仪器设备有限公司）；摇床（ZD-85A，常州国宇仪器制造有限公司）；培养箱（DNP-9402AE型，上海三发科学仪器有限公司）；干燥箱（DHG-9203A，上海三发科学仪器有限公司）等。1.2方法1.2.1菌种活化。配置PDA培养基（马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然），将培养基与培养皿放入高压蒸汽锅灭菌。灭菌后，在超净工作台制作PDA平板，并使用接种环挑取黑木耳斜面菌种，接种于PDA平板，然后将平板置于28 培养箱中培养1014 d，冰箱4 保存备用。1.2.2液体发
11、酵培养。液体发酵培养基配方16：20%葡萄糖，2%酵母膏，0.2%KH2PO4，0.1%MgSO47H2O。将上述液体发酵培养基按照40%的装液量分别装于250 mL的锥形瓶中，随后进行高压蒸汽灭菌。灭菌冷却后，于超净工作台无菌条件下用接种环挑取34个约1 cm2大小的菌种块，接种于液体发酵培养基中。接种后，为让菌种充分活化，便于菌种萌发，将三角瓶先置于25 恒温培养箱中静置培养1 d。第2 d再置于25 的摇床中以150 r/min振荡培养7 d。1.2.3黑木耳液体发酵菌丝体中黑色素的提取。用8层纱布过滤黑木耳液体发酵培养液中的菌丝体，并用蒸馏水反复冲洗过滤23次，过滤后的菌丝体置于65
12、的干燥箱中干燥24 h，取干燥后的菌丝体置于研钵中研磨成颗粒状或者粉状，保存备用。采用碱溶酸沉法进行黑色素的提取17-18，其具体操作步骤：精确称取0.2 g黑木耳菌丝体粉末状样品，加入试管中，按照 1 30 的料液比，加入 1 mol/LNaOH溶液，搅拌均匀后，置于80 水浴锅中浸提1 h；使用高速离心机在10 000 r/min的条件下对步骤的浸提液离心15 min，离心后取上清液置于试管中；使用1.5 mol/L HCl溶液调节pH至1.5，随后放入水浴锅中浸提12 h；12 h后，将浸提液7 500 r/min高速离心10 min，保留沉淀弃上清液，此时的沉淀即为黑色素粗品；重复步骤
13、23次，使用去离子水对最终沉淀物反复清洗34次，收集沉淀物，即为黑色素纯品，干燥后置于-20 保存。1.2.4黑色素得率的测定。黑色素的质量采用恒重差值法测定。将培养皿和滤纸提前置于105 干燥箱中，烘干至恒重（0.000 1 g），称重。将上述提取的黑色素产品倒入已恒重的装有滤纸的培养皿中再次烘干至恒重，称量。前后差值即为黑色素纯品的质量。黑色素得率计算公式：黑色素得率（%）=（黑木耳黑色素纯品质量黑木耳菌丝体质量）100。1.2.5黑木耳黑色素液体发酵培养条件的研究。（1）最适起始pH筛选。因为黑木耳生长环境为酸性19，所以分别设置起始pH值为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5的液体发
14、酵培养基，按照40%的装液量将摇瓶液体发酵培养基分装在250 mL三角瓶中，每个处理3个重复，在121 下高压蒸汽灭菌20 min。待灭菌冷却后，无菌条件下分别接入34个约1 cm2大小的菌种块。接种后，置于28 恒温培养箱中静止培养1 d，再放入25 的摇床中以150 r/min培养7 d。按照1.2.4中的方法进行黑木耳黑色素得率的测定。（2）最适温度筛选。使用上述筛选得到的最适-32pH，按照40%的装液量将液体发酵培养基分装在250 mL的三角瓶中，共计15瓶。在121 下高压蒸汽灭菌20 min。待灭菌冷却后，无菌条件下分别接入34个约1 cm2大小的菌种块。接种后，置于28 恒温培
15、养箱中静止培养1 d，然后，分别置于17、21、25、29、33的培养温度下，以150 r/min培养7 d，每个不同处理3个重复。随后，按照1.2.3和1.2.4中的方法进行黑木耳黑色素得率的测定。（3）最适培养天数筛选。利用上述筛选得到的最佳培养起始pH配制液体发酵培养基，按照40%的装液量将液体发酵培养基分装在250 mL三角瓶中，共计15瓶。在121 下高压蒸汽灭菌20 min。待灭菌冷却后，无菌条件下分别接入34个约1 cm2大小的菌种块。接种后，置于28恒温培养箱中静止培养1 d，然后以转速150 r/min的摇床分别培养5、7、9、11、13 d，每个处理3个重复。随后，按照1.
16、2.4中的方法进行黑木耳黑色素得率的测定。1.2.6黑木耳液体发酵菌丝体中黑色素的提取工艺研究。（1）最适浸提时间筛选。按照1.2.3中方法，获得黑木耳液体发酵菌丝体粉末状样品。在采用碱溶酸沉法进行黑色素的提取时，分别设置浸提时间为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h的不同试验处理，每个处理3个重复，根据1.2.4中的方法，获得不同处理的黑色素得率，通过不同处理之间的差异性分析，获得黑木耳液体发酵菌丝体中黑色素的最佳浸提时间。（2）浸提最适NaOH浓度筛选。在采用碱溶酸沉法进行黑色素的提取时，设置NaOH浓度为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mol/L的5个不同处理，每个处理3个重复。根据上述试验筛选的最佳浸提时间进行黑木耳液体发酵菌丝体粉末状样品中黑色素的提取，根据1.2.4中的方法，获得不同处理的黑色素得率，通过不同处理之间的差异性分析，获得黑木耳液体发酵菌丝体中黑色素提取时的最佳NaOH浓度。（3）浸提最适料液比筛选。采用碱溶酸沉法进行黑色素的提取时，料液比分别按照1 20、1 25、1 30、1 35、1 40 5个不同的试验处理进行设置，每个处理3个重复。依据上