1、中华人民共和国国家标准微生物超低频突变测定双重测序法GB/T38481一2020中国标准出版社出版发行北京市朝阳区和平里西街甲2号(100029)北京市西城区三里河北街16号(100045)网址：www,spc.org.Cn服务热线：400-168-00102020年11月第一版书号：1550661-63938版权专有侵权必究GB/T38481-2020微生物超低频突变测定双重测序法1范围本标准规定了用双重测序法测定微生物超低频突变的方法。本标准适用于微生物基因组或基因片段超低频突变的测定。2规范性引用文件下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。
2、凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。GB/T6682分析实险室用水规格和试脸方法3术语和定义下列术语和定义适用于本文件。3.1超低频突变ultralow-frequency mutations化学、物理或生物因素导致微生物DNA发生的频率低于110的永久性改变。3.2条形码标签barcode label接在待测DNA片段两侧的核苷酸片段，用以标示同一扩增家族的DNA,协助进行突变位点的确认，3.3互补标签家族complementary tag family所有含两端互补条形码标签的DNA片段。3.4双链同源序列double-strand consensus se
3、quences;DCSs带有相同条形码标签的双链DNA序列，包含反向互补链。4原理在待则DNA片段两端接上一段12t随机且互补的双链核苷酸条形码标签，然后对所有带有条形码标签的序列进行双重的高通量测序。利用12随机互补标签，排除掉测序文库制备过程中所引入的突变，进而准确检测突变位点和突变率。5试剂除非另有规定，仅使用分析纯试剂。5.1水。GB/T6682,一级。5.2接头链标签序列：GB/T38481-2020a)5-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3:b)5-TCTTCTACAGTCANNNNNNNNNNN
4、NAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC-3.N为A、T、C或G,由12个随机威基组成标签片段。将寡核苷酸溶解于Tis-EDTA缓冲液(5.8)或纯水中至终浓度100mol/L,并放置于一20保存。5.3接头链打扩增引物序列：a)5-AATGATACGGCGACCACCGAG-3:b)5-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATXXXXXXGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGC-3.X为按样品需求设计的文库标记序列。将寡核苷酸溶解于Tris-EDTA缓冲液(5.8)或纯水中至终浓度20mol/L,并放置于-20保存。5.4基因提取试剂盒。5.5高通
5、量测序建库试剂盒。5.6DNA分选磁珠试剂盒，5.7DNA分析试剂盒，5.8三羟甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸(Tris-EDTA)缓冲液，pH8.0。由10mmol/L的分析纯Tris和0.1mmol/L的EDTA配制，调整pH值至8.0。6仪器设备及器具6.1PCR扩增仪。62磁性分离器。6.3高通量测序仪。6.4核酸分析系统。6.5电子天平：精度为0.01g。7样品制备7.1DNA提取利用微生物基因组或质粒提取试剂盒对待测样本进行基因组或质粒DNA提取操作，最后使用50L的无菌双蒸水进行DNA洗脱。提取得到的DNA样品使用核酸定量仪检测核酸的浓度和纯度。7.2DNA片段化和末端修复利用高通量基因测序建库试剂盒，将待测样品DNA片段化至100bp1000bp,将末端修复为A尾。8接头条形码标签的合成8.1退火将浓度100mol/L的两个接头链寡核苷酸片段各取100L进行退火，在95下加热5min后，自然降温，并净置1h。8.2延伸将8.1中得到的产物按试剂说明与脱氧核糖核苷三磷酸混合物(NTPs)和克列诺酶混合均匀，分装至两个0.2mL的PCR管中并在37下孵育1h。2