1、流式细胞术的原理(yunl)及应用,无锡二院检验科,第一页，共五十页。,流式细胞术的基本概念,流式细胞术(flow cytometry,FCM)是以流式细胞仪为检测手段，能够(nnggu)快速、精确的对单个细胞或颗粒的物理和化学特性（如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等）进行多参数定量分析和分选的技术。,第二页，共五十页。,流 式 细 胞 术 的 特 点,（1）流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器的结构及功能不被破坏的状态下，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化(chn hu)分选。（2）测量快速、大量、准确、灵敏、定量,第三页，共五十页。,流式细胞仪的检测(ji
2、n c)范围,细胞结构(jigu)细胞大小细胞颗粒度DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量,细胞功能 细胞表面(biomin)/胞浆/核的 特异性抗原 细胞活性 细胞内/外的细胞因子 激素结合位点 细胞受体 钙离子浓度 线粒体膜电位,第四页，共五十页。,一、流式细胞仪的工作(gngzu)原理,采用激光作为激发光源，保证(bozhng)其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。,第五页，共五十页。,1.流式细胞仪的基本(jbn)结构,
3、（1）液流系统(xtng)（2）光学系统（3）数据处理系统,第六页，共五十页。,（1）液 流 系 统,单细胞悬液 大多数仪器检测范围是在50-300 m 大小。将细胞悬液注射进入鞘液中这一过程,称为(chn wi)流体动力学聚焦,第七页，共五十页。,液 流 系 统 示 意 图,第八页，共五十页。,（2）光 学 系 统,由激光光源、分色反光镜、光束成形器、透镜(tujng)组、滤片和光电倍增管组成。,第九页，共五十页。,流 式 细 胞 仪 与 显 微 镜 的 区 别,第十页，共五十页。,二、散 射 光 的 测 量,细胞在液柱中与激光束相交时向周围(zhuwi)360立体角方向散射的光线信号，它的
4、强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光和侧向散射光。,第十一页，共五十页。,前 向 散 射 光（FS）,前向散射光（forward scatter,FS）：激光束照射细胞(xbo)时，光以相对轴较小角度(0.510)向前方散射的讯号用于检测细胞等粒子的表面属性，信号强弱与细胞体积大小成正比。,通常在FCM应用中，选取FS作阈值，来排除样品(yngpn)中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。,第十二页，共五十页。,前 向 散 射 光 示 意 图,第十三页，共五十页。,前向散射光,第十四页，共五十页。,侧 向 散 射 光（SS）,侧向散射光（side sca
5、tter,SS）：激光束照射细胞时，光以90角散射的讯号，用于检测(jin c)细胞内部结构属性。,第十五页，共五十页。,侧 向 散 射 光 示 意 图,第十六页，共五十页。,侧向(c xin)散射光,第十七页，共五十页。,光 散 射 测 量 的 用 途,测得的FS与SS信号通过计算机处理，可得到(d do)FS-SS图，由此可仅用散射光信号对未染色的活细胞进行分析或分选。此为血细胞分类的基本原理，但不能分析表面分子。,光散射(snsh)测量最有效用途：从非均一群体中鉴别出某些亚群,第十八页，共五十页。,三、荧 光 的 测 量,荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波
6、长与激发光波长不同。每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管。选择不同的单抗及染料就可同时测定一个(y)细胞上的多个不同特征。,第十九页，共五十页。,荧 光 染 料 的 特 性,第二十页，共五十页。,荧 光 信 号 的 检 测,使用荧光标记的单克隆抗体染色，做多色分析荧光信号(xnho)的强弱，反映了细胞抗原的表达含量,第二十一页，共五十页。,第二十二页，共五十页。,荧 光 补 偿,第二十三页，共五十页。,5 Color Single Laser(488nm)FITC/PE/ECD/PC5/PC7,第二十四页，共
7、五十页。,四、细 胞 分 选 原 理,通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有(jyu)某种特征的细胞需进一步培养和研究时进行的。,第二十五页，共五十页。,细 胞 分 选 示 意 图,第二十六页，共五十页。,第二十七页，共五十页。,五、数 据 的 显 示 与 分 析,参数：FS,SS,FL数据显示方式（单参数直方图、双参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图）设门分析(fnx)技术,第二十八页，共五十页。,（一）参 数 说 明,FS：反映颗粒的大小(dxio)SS：反映颗粒的内部结构复杂程度FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少以及荧光种类,第二十九页，共五十页。,（二）数 据 显 示
8、方 式,直分析(fnx)方图,单参数(cnsh)直方图双参数直方图:点图 二维等高图 假三维等高图三参数直方图多参数分析,第三十页，共五十页。,1.单 参 数 直 方 图,由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数(COUNT)构成(guchng)，反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,第三十一页，共五十页。,单 参 数 直 方 图,第三十二页，共五十页。,2.双 参 数 直 方 图,双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就可以确定细胞在图上的表达(biod)位置。双参数信号通常采用对数信号，最常用的是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同
9、样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。,第三十三页，共五十页。,双 参 数 直 方 图 点 图,第三十四页，共五十页。,（三）设 门 分 析 技 术,1.Gate设置：指根据该图的细胞群分布选定(xun dn)其中想要分析的特定细胞群。,根据门的形状(xngzhun)又分为了线性门、矩形门、圆形门、多边形门、任意形状(xngzhun)门和十字门。,第三十五页，共五十页。,A 淋巴细胞B 单核细胞C 中性(zhngxng)粒细胞,A、B、C均为任意(rny)门,第三十六页，共五十页。,线性门,第三十七页，共五十页。,2.区阈（Region设置(shzh)）:,如十字门分析(fnx)时，由四个区阈构
10、成，即G=D1+D2+D3+D4。,D1：CD4+/CD3-D2：CD4+/CD3+D3：CD4-/CD3-D4：CD4-/CD3+,第三十八页，共五十页。,（1）淋巴细胞亚群检测(jin c)：CD3,CD4,CD8,CD16+56,CD19 免疫功能的变化监测，AIDS（2）HLA-B27:强直性脊柱炎（3）白血病免疫分型：白血病的分类（4）贫血的鉴定：PNH（CD55,CD59）,血小板抗体(5).,六、流式细胞术的临床(ln chun)应用,第三十九页，共五十页。,七、流 式 细 胞 仪 的 科 研 应 用,细胞周期的分析(fnx)干细胞研究癌症病人的多药耐药性细胞动力学功能研究环境微
11、生物分析流式细胞术与分子生物学研究流式细胞术在免疫检验中的应用,第四十页，共五十页。,DNA 细 胞 周 期 分 析,第四十一页，共五十页。,第四十二页，共五十页。,PI染色(rns)检测细胞周期 Protocol,离心收集细胞，弃上清，用PBS洗细胞两次。加入预冷的70%乙醇，于40C固定过夜(guy)，或-200C长期固定。细胞染色：离心收集细胞，用1mlPBS洗细胞一次，加入500ulPBS（含50ug/ml溴化乙锭（PI），100ug/mlRNase A,0.2%Triton X-100)40C避光孵育30分钟。流式细胞仪检测：一般细胞计数2-3万个。结果用软件Modfit分析。,第四
12、十三页，共五十页。,第四十四页，共五十页。,细 胞 凋 亡 的 检 测,细胞形态及细胞膜通透性的变化(Hoechest 33342和碘化丙啶（propidium iodide，PI）Caspases激活(Caspase-3)线粒体跨膜电位降低(Rhodamine123）膜磷脂酰丝氨酸外化(Annexin V-FITC/PI)Ca2+浓度升高(Fluo-3）DNA断裂(dun li)及含量的变化(TUNEL 和 PI）,第四十五页，共五十页。,Annexin-V 和 PI 双 染 protocol,细胞用冷PBS洗涤二次并在恰当(qidng)的染色缓冲液（binding buffer）中以1 x
13、 106 细胞/mL的浓度重悬吸取100ul的细胞(1 x 105)至试管中。加进适量的荧光标记的annexin-V试剂和PI。混匀后避光室温下孵育15分钟。（必须在室温下进行）孵育后加进400ul染色缓冲液，立即上流式细胞仪分析。,第四十六页，共五十页。,Annexin-V和PI双染的特点(tdin)和注意事项,检测特点：简便，快速，准确区分活细胞、凋亡细胞和坏死细胞。注意事项：1.细胞制备（如贴壁细胞）和储存时细胞膜的破损会导致磷脂酰丝氨酸(PS)跨膜分布的改变，造成假阳性。2.染色(rns)后立即上机检测。,第四十七页，共五十页。,Q3:正常细胞(xbo)；Q4：早期凋亡细胞；Q2：晚期凋亡细胞；Q1：坏死细胞。,第四十八页，共五十页。,谢谢(xi xie)大家,对比-流式细胞仪是一种(y zhn)特殊的显微镜,第四十九页，共五十页。,内容(nirng)总结,流式细胞术的原理及应用。用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度与统计分析精确性。参数：FS,SS,FL。FL：反映颗粒(kl)被染上的荧光数量多少以及荧光种类。D2：CD4+/CD3+。D3：CD4-/CD3-。（1）淋巴细胞亚群检测：CD3,CD4,CD8,CD16+56,CD19。Annexin-V和PI双染的特点和注意事项,第五十页，共五十页。,