1、,第一页，共七十四页。,Identification of cultured adult rat RGCs.Cultured cells were co-labeled with anti-Thy-1 antibody(A),anti-NF-L antibody(B),and DAPI(C).(D)A digitally merged image simultaneously represents all three fluorescent labels.(E)The corresponding phase-contrast image.,第二页，共七十四页。,免疫荧光染色法,用于标记(bio
2、j)二抗体的荧光素：（1）异硫氰酸荧光素（FITC）发射的荧光波长为490619（绿色荧光）（2）四乙基罗丹明：荧光波长为540660（橙红色荧光）（3）DAPI或Hoechst33258:染核，用紫外激发,第三页，共七十四页。,免疫荧光的染色(rns)步骤,1、用95%乙醇固定(gdng)细胞10-30 分或用冷丙酮固定510分。2、用PBS洗3次。3、用PBS配制的1Triton 10分。用PBS洗3次4、用2%5%BSA封闭2 小时5、加入一抗过夜，PBS洗3次6、加入二抗12小时，PBS洗3次7、核复染，荧光显微镜观察。,第四页，共七十四页。,正常细胞(xbo)和组织的培养,一、上皮细
3、胞培养(epithelial culture)上皮细胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分(chng fn)，又由于癌起源于上皮组织，故上皮细胞培养特别受到重视。但上皮细胞培养中常混杂有成纤维细胞，培养时生长速度往往超过上皮细胞，并难以纯化，同时上皮细胞难以在体外长期生存，因此纯化和延长生存时间是培养关键。,第五页，共七十四页。,体内上皮细胞生长在胶原构成的基膜，因此培养在有胶原的底物上可能(knng)利于生长，另外人或小鼠表皮细胞培养在以3T3细胞为饲养层（用射线照射后）时，细胞易生长并可发生一定程度的分化现象。降低PH、Ca2+含量和温度，向培养基中加入表皮生长因子，均有利于表皮
4、细胞生长。,第六页，共七十四页。,表皮细胞培养1、取材：外科植皮或手术残余皮肤(p f)小块，早产流产儿皮肤(p f)更好，取角化层薄者，切成0.51平方厘米小块。2、置0.02%EDTA中，室温，5分钟。3、换入0.25%胰蛋白酶中，4过夜。4、分离：取出皮块，用血管钳或镊子将表皮与真皮层分开。5、取出表皮，剪成更小的块后，置0.25%胰酶中，37，3060分钟。6、反复吹打，制成悬液。7、培养：用80目不锈钢纱网滤过后，低速离心，吸去上清。8、直接加入培养基（Eagle加20%小牛血清）制成细胞悬液，接种入培养瓶，CO2温箱培养。,第七页，共七十四页。,第八页，共七十四页。,Culture
5、d Mouse Mammary Epithelial Cells,第九页，共七十四页。,神经(shnjng)胶质细胞培养,神经细胞（神经元不易培养，只有(zhyu)在适宜情况下，如接种在胶原底层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增值。而神经胶质细胞是神经组织中比较容易培养的成分。人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。一般说来，胶质细胞在培养中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，,第十页，共七十四页。,获取脑组织后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂
6、洗一、二次。2、置于3050倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打即制成细胞悬液。3、把悬液注入离心管室温中直立510分钟后，细胞或细胞团快自然下沉，脂肪等杂物易漂浮，可吸除上层、反复二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞成分。4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网过滤，计数并调整细胞密度。5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖(zngzh)状态。细胞传代可以0.25%胰酶消化处理。,第十一页，共七十四页。,Cultured neuron,第十二页，共
7、七十四页。,Cultured microglia,第十三页，共七十四页。,大鼠肝细胞的培养(piyng)(成年),培养液:Koga 培养液,最好(zu ho)加入Williams 和Waymouth MB752/1)消化液:型胶原酶300U/mg,使用浓度为0.025%方法:1 灌流法分离肝细胞：门静脉和下腔插管静脉插管2、用预灌流液(8.3 mg/ml NaCl,0.5 mg/ml KCl,2.4 mg/ml HEPES,pH 7.4)灌流8分钟,第十四页，共七十四页。,3、用含0.05%胶原酶的灌流液(预灌流液中加入5 mmol/LCaCl2,0.05%胶原酶)继续灌流10分钟。4、将肝叶
8、剪下,将消化好的肝细胞轻轻刮下,获得的肝细胞悬液离心(lxn)(600 r/min)三次,每次2分钟 5、然后重新悬浮于WE培养基中(含10%血清,Insulin 0.2 U/ml,L-Glutamine 0.292 mg/ml，100 nM dexamethasone)。6、Isolated cells were plated on collagen type I-coated dishes in medium I consisting of Williams medium E。,第十五页，共七十四页。,Hepatocyte Isolation and Culture Hepatocytes
9、 were isolated from the liver of fed male BALB/c mice(22-25 g)by using the two-step collagenase perfusion method.After the induction of anesthesia with pentobarbital sodium(400mg/kg ip),the peritoneal cavity was opened,and the liver was perfused in situ via the portal vein for 4min at 37C with calci
10、um-free HEPES buffer and for 7min with HEPES buffer containing 45mg/100 ml collagenase D(Boehringer-Mannheim,Laval,QC,Canada)and 135mg/100 ml CaCl2.The perfusion rate was set at 5ml/min for both solutions.,第十六页，共七十四页。,The cells were used only if cell viability,as determined by trypan blue exclusion,
11、was 80%.The cells were seeded onto plastic petri dishes(26,000cells/cm2)in Williams medium E(GIBCO BRL,Toronto,ON,Canada)supplemented with 10%fetal bovine serum(GIBCO BRL)and allowed 90min to attach.The serum-containing medium was then removed,and the cells were subjected to different culture condit
12、ions in serum-free medium.,第十七页，共七十四页。,Fig.5.Morphology of EGF-treated mouse hepatocytes in the presence and absence of PD-168393.Primary mouse hepatocyte cultures were incubated with medium(untreated)or EGF(50ng/ml)in the presence or absence of 10M PD-168393.After 24h in culture,EGF-treated hepatoc
13、ytes were spread,and their cell surface increased compared with untreated cells.Hepatocytes treated with EGF in the presence of PD-168393 were spheroid and resembled control cells with or without PD-168393.Magnification,100.,第十八页，共七十四页。,大鼠心肌细胞的培养(piyng),新生(xnshng)大鼠鼠龄的选择新生大鼠心肌细胞在出生后3d内具有部分的增殖能力,成年大鼠
14、心肌细胞则为终末分化细胞,不再具有分裂增殖能力.因此,大鼠出生时间越短,其心肌细胞分离后成活率越高,越容易贴壁生长.大量观测表明,选择13 d龄大鼠分离其心肌细胞进行原代培养较为理想.其中尤以半日龄大鼠心肌细胞培养效果最佳.,第十九页，共七十四页。,神经细胞(shn jn x bo)分散培养,（一）选材 常用(chn yn)胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用(chn yn)胚龄6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜，小鼠以18d为宜，大鼠纹状体以10d为宜；若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚，则黑质以13d，纹状体18-21d为宜；小脑以2
15、0-21d小鼠胚胎，所获蒲氏细胞成活率高，颗粒细胞正在分化；脊髓与DRG联合培养，常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神经成活率高。,第二十页，共七十四页。,(二）取材。脑则取出相应组织，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上，用小刀将其要成背腹两侧，分别培养(piyng)。（三）细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37孵育30min，移入接种液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用细口吸管吹打细胞悬液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上层细胞悬液，计数，预置细胞密度，接种于培养皿（1106），做电生理应为5105或更低。,第二十一页，共七十四页。
16、,（四）抑制胶质细胞生长。培养3-5d后，也有人认为培养7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。（五）观察。接种6-12h，开始贴壁，并有集合现象，细胞生长突起明显，5-7d胶质细胞增生明显，7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面(xi mian)，形成地毯，2周时神经细胞生长最丰满，四周晕光明显，一个月后，有些神经细胞开始退化，变形，甚至出现空泡，一般培养2-4周最宜。,第二十二页，共七十四页。,但神经细胞(xbo)只能增大，而不能增殖，只能原代，不能传代，不会有细胞(xbo)周期，而且随培养时间的延长，细胞(xbo)数量在下降，但胶质细胞(xbo)可以，神经胶质细胞(xbo)也可以。在培养过程中，早期9-12d时，有较多的神经细胞(xbo)死亡，这是第一次死亡阶段，应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞(xbo)一般突起长而多，且相互形成突触。,第二十三页，共七十四页。,Neuronal culture,1.Rat pups aged l-l 5 d,were killed by cervical dislocation.2.Cortex placed in Ea