1、第4章 细菌(xjn)药物敏感试验及其耐药表型检测王辉 北京大学医学部,第一页，共八十一页。,抗菌药物(yow)敏感试验,测定抗菌药物(yow)在体外对病原微生物有无抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物(yow)敏感性试验（Antimicrobial Susceptibility Test），简称药敏试验（AST）。,第二页，共八十一页。,药敏试验(shyn)的意义,预测抗菌治疗的效果；指导抗菌药物的临床应用；发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临床医生选择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药；监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制(kngzh)和预防耐药菌感染的发生和
2、流行。,第三页，共八十一页。,药敏试验(shyn),MIC：在与微生物生长速率有关的特定时间(shjin)间隔内，通常是1824小时，能够抑制被测菌生长的最低药物浓度。对倍稀释的优点：操作容易敏感株的MIC呈正态分布区分异常(R)与敏感(S)的菌群,第四页，共八十一页。,药敏试验(shyn)折点的建立,1.MIC的分布2.药代动力学和药效学 定 MIC的折点3.临床疗效和细菌(xjn)清除率4.抑菌圈直径的分布 定抑菌圈折点统计学的线性回归计算错误率：尽可能减少极重要误差(假敏感率),第五页，共八十一页。,MIC的分布(fnb),第六页，共八十一页。,药代动力学和药效学,药代动力学：药物吸收，
3、分布，代谢，排泄药效学：药物对机体(jt)的作用时间依赖型（TMIC：-内酰胺类，大环内酯类浓度依赖型（AUC/MIC比率：AGS,FQ这些参数可用于计算具有最佳药效的给药方案,第七页，共八十一页。,MIC与抑菌圈直径(zhjng)的线性关系,耐药 中介(zhngji)敏感,R,I,S,Log2.MIC,D 1 d2 抑菌圈直径(zhjng)（mm),v,第八页，共八十一页。,抑菌圈直径(zhjng)与MIC的关系,第九页，共八十一页。,不同国家的判定(pndng)折点可能不同,原因：用药剂量不同，服药的间隔不同评价敏感时较保守更强调检测出耐药株（即特定(tdng)的耐药群）技术因素：接种、培
4、养基在我国主要遵循临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI）制定的抗菌药物选择原则。,第十页，共八十一页。,敏感性分类(fn li)(CLSI的定义),敏感（Susceptible）用常规用量治疗有效常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的MIC 5倍以上。耐药（Resistance）用常规用量治疗不能抑制细菌的生长MIC高于药物(yow)在血、体液中可能达到的浓度,第十一页，共八十一页。,敏感性分类(fn li)（2）,中介(Intermediate)MIC接近血、体液中药物的浓度，治疗(zhlio)反应率低于敏感
5、株药物生理浓集部位有效(尿-FQ)加大用药剂量可能有效缓冲区：防止操作的系统误差造成重大结果的判定错误,第十二页，共八十一页。,药敏试验(shyn)的方法学,半定量纸片扩散(kusn)法(抑菌圈直径)MIC法：稀释法(肉汤、琼脂)自动化仪法抗生素连续梯度法(Etest)流式细胞仪,第十三页，共八十一页。,将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后不断向纸片周围扩散(kusn)形成递减的梯度浓度，在纸片周围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即为抑菌圈。抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相
6、关关系。,纸片扩散(kusn)法（Kirby-Bauer法）,第十四页，共八十一页。,纸片扩散(kusn)法,水解酪蛋白（MH）培养基，pH7.27.4，做成琼脂厚度4mm，直径90mm的平板；挑取孵育16 24小时已分纯菌落，置于生理盐水管中，振荡混匀后校正浓度(nngd)至0.5麦氏标准。,第十五页，共八十一页。,纸片扩散(kusn)法,用无菌棉拭子蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液；然后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度；最后沿平板内缘涂抹1周；平板在室温下干燥35min，用无菌镊子(ni zi)或商品化的纸片分配器将含药纸片紧贴于琼脂表面，各纸片中心距离应大于24mm
7、，纸片距平板内缘大于15mm。,第十六页，共八十一页。,纸片扩散(kusn)法,35孵育1624小时(xiosh)量取抑菌圈直径；根据抑菌环的直径，按照CLSI标准判读，报告敏感、中介、耐药。,第十七页，共八十一页。,2023/6/27,18,纸片扩散(kusn)法影响因素,MIC接种菌量细菌生长率抗生素含量(hnling)、扩散性平皿厚度温度，预孵育时间,第十八页，共八十一页。,2023/6/27,19,纸片扩散(kusn)法标准化,CLSI：美国实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute)每年修订更改包括质控新药的判定标准特殊
8、(tsh)耐药性的检测,第十九页，共八十一页。,2023/6/27,20,CLSI的法规(fgu),规定纸片含量、接种浓度、培养基、平皿厚度、判定标准(biozhn)、质控；规定常规测试报告的抗生素；不同的药判定标准不同；不同的菌判定标准也不同。,第二十页，共八十一页。,2023/6/27,21,常规测试并报告(bogo)的药物分组(1),肠杆菌(gnjn)科 绿脓和非肠杆菌科一 级 氨苄西林 头孢他啶，庆大霉素 头孢唑林，庆大霉素替卡西林，哌拉西林二级 阿米卡星 阿米卡星 氨苄西林/舒巴坦 头孢吡肟，头孢哌酮 阿莫西林/克拉维酸氨曲南 头孢呋肟，头霉素环丙沙星，亚胺培南 头孢噻肟，头孢曲松
9、替卡西林/克拉维酸 环丙沙星，亚胺培南 妥布霉素，复方磺胺 替卡西林，哌拉西林 三级 氨曲南，头孢他啶头孢曲松 卡那霉素，奈替米星 氯霉素，奈替米星 妥布霉素 四环素，氯霉素,第二十一页，共八十一页。,2023/6/27,22,常规(chnggu)测试并报告的药物分组(2),葡萄球菌(p to qi jn)肠球菌一级 苯唑西林，青霉素 青霉素，氨苄西林二级 红霉素类万古霉素 克林霉素，万古霉素三级 氯霉素庆大霉素,第二十二页，共八十一页。,2023/6/27,23,常规(chnggu)测试并报告的药物分组(3),流感嗜血杆菌肺炎(fiyn)链球菌一级 氨苄西林，青霉素青霉素，红霉素 复方磺胺
10、复方磺胺二级 头孢呋肟，头孢噻肟氧氟沙星，四环素 头孢他啶，氯霉素 万古霉素三级 阿奇霉素，头孢克罗氯霉素，利福平 环丙沙星，亚胺培南利福平，四环素,第二十三页，共八十一页。,2023/6/27,24,预报(ybo)用药(一),测试药菌名推测其他药物的敏感性 苯唑西林葡萄球菌所有-内酰胺类 四环素所有（除葡多西环素，米诺环素 萄球菌和不 动杆菌(gnjn)红霉素G球菌罗红霉素，克拉霉素，阿奇霉素克林霉素所有林可霉素,第二十四页，共八十一页。,2023/6/27,25,预报(ybo)用药(二),测试药菌名推测其他药物的敏感性氨苄西林肠球菌青霉素青霉素G葡萄球菌氨苄西林，美洛西林 替卡西林头孢噻吩
11、肠杆菌(gnjn)科头孢拉定，头孢氨苄 头孢克罗奈啶酸肠杆菌科所有氟喹诺酮类万古霉素所有替考拉宁,第二十五页，共八十一页。,以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培养后观察(gunch)其最低抑菌浓度。稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培养基者为肉汤稀释法。,药敏试验(shyn)-稀释法,第二十六页，共八十一页。,常用抗菌药物容积(rngj)稀释法,第二十七页，共八十一页。,抗菌药物的稀释(xsh)和融解,第二十八页，共八十一页。,2023/6/27,29,肉汤稀释(xsh)法,4 8 16 32 64 128 256 ug/ml,混,混
12、 清,抗生素倍比稀释(xsh)，种菌105CFU/ml，孵育35，1620h，判读。,第二十九页，共八十一页。,2023/6/27,30,肉汤稀释(xsh)法,调节离子(lz)浓度的MH肉汤宏量肉汤法（2ml,13x100mm）微量肉汤法（0.1ml,微量板）自动化仪优点：准确，可靠，可用于研究。缺点：劳动强度大细菌生长情况不可查,第三十页，共八十一页。,2023/6/27,31,琼脂(qingzh)稀释法,浓度(nngd)16 32 64 128 256 ug/ml,制备含对倍抗生素浓度梯度的平板，制备菌悬液，点种菌，104/每个点，孵育(f y)，判读结果,第三十一页，共八十一页。,202
13、3/6/27,32,琼脂(qingzh)稀释法,优点：金标准 精确可靠(kko)可同时测定多株菌（40株）细菌生长情况可查缺点：测多个药时劳动强度大制备平皿费时费力,第三十二页，共八十一页。,E test 法,E试条是一条5mm50mm的无孔试剂载体，一面固定有一系列预先制备的，浓度呈连续指数增长稀释抗菌药物，另一面有读数和判别的刻度；抗菌药物的梯度可覆盖有20个MIC对倍稀释浓度的宽度范围；将E试条放在细菌接种过的琼脂平板上，经孵育过夜，围绕试条明显可见椭圆形抑菌圈，圈的边缘(binyun)与试条交点的刻度浓度即为抗菌药物抑制细菌的最小抑菌浓度。,第三十三页，共八十一页。,2023/6/27
14、,wanghui-ART,34,E test 法,细菌(xjn)生长区,E test 塑料(slio)条,椭圆形细菌生长(shngzhng)抑制区,256128 8016,判读抑菌浓度（MIC ug/ml),第三十四页，共八十一页。,E test 法,菌液制备(zhbi)及接种均同纸片扩散法。90mm平板上可放E试验试条1 2条，140mm平板最多可放6条。孵育温度及时间同纸片扩散法。,第三十五页，共八十一页。,2023/6/27,36,E test 法,优点连续浓度梯度，与琼脂(qingzh)稀释法相关性好影响因素少，稳定性高操作简单，省时缺点：昂贵用途：快生长菌，苛养菌，厌氧菌，酵母菌，分
15、枝杆菌,第三十六页，共八十一页。,2023/6/27,37,评价(pngji)药物体外抗菌活性的指标,MIC50,MIC90,MIC 均值，MIC 范围(fnwi)，R，I，SMIC50/MIC90：MIC从小到大排列，位于第50/90百分位菌株的MIC值单纯比较MIC50，MIC90是片面的，还要同时看平均MIC及MIC范围同时结合R，I，S，(不同药物血浓度不同，安全范围不同),第三十七页，共八十一页。,细菌(xjn)耐药机制,细菌耐药机制主要有四种：产生一种或多种水解酶、钝化酶和修饰酶；抗生素作用的靶位改变，包括青霉素结合蛋白位点、DNA解旋酶、DNA拓扑异构酶的改变等；细菌膜的通透性下
16、降，包括细菌生物被膜的形成和通道蛋白丢失(dis)；细菌主动外排系统的过度表达。在上述耐药机制中，第一、二种耐药机制具有专一性，第三、四种耐药机制不具有专一性。,第三十八页，共八十一页。,-内酰胺酶,内酰胺酶是一类(y li)水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中；检测方法有微生物培养法、碘淀粉法、头孢硝噻吩纸片法。其中头孢硝噻吩纸片法因为简单、方便、快速，应用于临床检测。,第三十九页，共八十一页。,葡萄球菌(p to qi jn)属 青霉素,CLSI M100-S20.Table 2C.,第四十页，共八十一页。,诱导(yudo)-内酰胺酶的检测,如果青霉素的药敏结果出现以下情况(qngkung)，需要做诱导-内酰胺酶的检测：MIC 0.12 g/ml Zone diameter 29 mm,第四十一页，共八十一页。,诱导(yudo)-内酰胺酶试验,苯唑西林(x ln)(诱导剂),接种纯菌落(jnlu)于琼脂上(例如，BAP,MHA)；贴-内酰胺类纸片(例如,苯唑西林,头孢西丁)；孵育过夜；测试抑菌圈周围的细菌；如果-内酰胺酶阳性,报告青霉