1、 年 月第 卷第 期陕 西 中 医 药 大 学 学 报 黄芩汤、葛根芩连汤对溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群的影响郑佳荟，李欢，赵重博，郭东艳，王晶，（陕西中医药大学秦药特色资源研究与开发国家重点实验室（培育）陕西省中药基础与新药研究重点实验室，陕西 咸阳；陕西中医药大学，陕西 咸阳）摘 要：目的 探讨黄芩汤、葛根芩连汤对溃疡性结肠炎（）小鼠肠道菌群的调节作用。方法 采用 葡聚糖硫酸钠（）水溶液自由饮用 建立 小鼠模型，同时连续 灌服不同剂量黄芩汤和葛根芩连汤，通过观察各组小鼠的体质量、疾病活动指数评分（）、结肠长度及组织病理学来评价两种复方对 小鼠的疗效，采用 高通量测序探究黄芩汤、葛根芩连汤对 小
2、鼠肠道菌群的影响。结果 与模型组比较，黄芩汤中、高剂量组与葛根芩连汤中、高剂量组均显著改善了小鼠结肠组织病理学、体质量、评分、结肠长度。在肠道菌群方面，两种复方均能调节门水平上的拟杆菌门（）、厚壁杆菌门（）的相对丰度；在属水平上均能降低有害菌大肠杆菌志贺菌属（）的相对丰度，其中，黄芩汤在增加有益菌乳杆菌属（）、毛螺菌属（）、肠杆菌属（）的相对丰度上优于葛根芩连汤；葛根芩连汤在增加有益菌布劳特氏菌属（）、降低有害菌变形菌门（）的相对丰度上优于黄芩汤。结论 黄芩汤中剂量在改善体质量、评分、结肠长度方面优于葛根芩连汤不同剂量组，且两种复方可能通过调节肠道菌群平衡从而减轻 诱导的，其中，黄芩汤在调节有
3、益菌的数目上优于葛根芩连汤。关键词：黄芩汤；葛根芩连汤；葡聚糖硫酸钠；肠道菌群中图分类号：文献标识码：文章编号：（）：，（），；，）：（）（），（），基金项目：国家自然科学基金项目（）通讯作者：王晶，博士，副教授。：陕 西 中 医 药 大 学 学 报 年 月第 卷第 期 ，；，；，：；溃疡性结肠炎（，）是一种慢性非特异性肠道炎症性疾病，与克罗恩病统称为炎症性肠病。的主要临床症状是腹泻、腹痛、体重减轻、便血等。已被世界卫生组织列为现代难治病之一。该病发病机制尚不清楚，但大量研究表明 与宿主基因、免疫系统紊乱、环境因素和肠道微生物影响有关。目前治疗 的常用药物包括美沙拉嗪、柳氮磺胺吡啶、免疫抑制剂
4、、皮质类固醇等。然而，这些药物均有一定的副作用，如恶心，头痛和头晕。因此，临床上急需开发新的、有效安全并且毒副作用较低的药物治疗。中医虽未记载“溃疡性结肠炎”病名，但诸多医家根据其特征，将其归属为“肠澼”“下利”等范畴。应用中医药治疗 效果显著，历史悠久。黄芩汤记载于张仲景的伤寒论第 条：“太阳与少阳合病，自下利者，与黄芩汤；若呕者，黄芩加半夏生姜汤主之”。此方由黄芩三两、炙甘草二两、芍药二两、大枣十二枚组成，具有清热止痢、平肝敛阴、和中降逆的功效，在医方集解中黄芩汤被称为“万世治痢之祖”。此方虽仅含四味药，但其组方十分严谨，后世治疗痢疾的相关方剂也多半由此方演化而来，如芍药汤、黄芩芍药汤等，
5、可见其功效之奇。现代药理研究表明，黄芩汤对 具有确切的治疗作用，以调节免疫功能、抑制炎症反应、抗氧化应激、保护肠黏膜屏障等方面作用显著，且副作用较小。葛根芩连汤出自伤寒论第 条：“太阳病，桂枝证，医反下之，利遂不止，脉促者，表未解也。喘而汗出者，葛根黄芩黄连汤主之”。此方由葛根半斤，黄芩、黄连各三两，炙甘草二两组成，为治身热下痢之代表方，现代临床研究表明葛根芩连汤对 的治疗具有一定的疗效，改善其临床症状，且副作用小。目前，许多研究表明肠道微生物群是介导能量生产、营养供应、宿主防御和免疫发育等方面的重要因素。肠道微生物群失衡可导致免疫功能障碍，引起炎症甚至细胞凋亡，破坏肠道生理功能。因此，肠道微
6、生物群在人类的健康和疾病中发挥着重要作用。研究指出肠道微生物与 的发展有着密切的关系，在 患者及 小鼠的体内肠道微生物失衡主要表现为细菌多样性下降、益生菌的减少、致病菌增加。等观察到 患者及动物模型中肠道微生物群的一些常见变化，如厚壁菌门（）的减少和变形菌门（）的增加。有研究指出在给予乳酸杆菌和双歧杆菌等有益菌后，可以缓解 患者的炎症，。因此，调节肠道微生物群来改善 可能是一种新的治疗方法。黄芩汤与葛根芩连汤作为治疗 的经典良方，在各自治疗 上有何优势与不同，目前尚不清楚。因此，我们课题组从肠道菌群角度来分析黄芩汤和葛根芩连汤在治疗 上的优势和不同。材料和方法 实验材料 只 级 雄性小鼠（，年
7、龄 周）购自成都达硕实验动物有限公司，动物许可证号（川）。所有实 验 小 鼠 在 标 准 的 环 境 条 件 下 温 度 年 月第 卷第 期陕 西 中 医 药 大 学 学 报 （），相对湿度（），昼夜交替饲养，可以自由获得食物和无菌水。动物实验遵循陕西中医药大学实验动物管理和使用的规定，符合 原则。药物与试剂 黄芩汤的制备：分别称取黄芩，白芍、大枣、炙甘草各 ，加入 倍量水，浸泡 ，煎煮 后，趁热过滤药液；药渣加 倍量水继续煎煮 ，过滤，合并 次水煎液，浓缩至含生药质量浓度为 ，置于 保存。葛根芩连汤的制备：分别称取葛根，黄芩 ，黄连 ，炙甘草，加入 倍量水，浸泡，先煎葛根，水沸后煎煮 ，再和
8、余药共煎煮，趁热过滤药液；残渣加 倍量水，水沸后煎煮 ，合并 次水煎液，浓缩至含生药质量浓度为 ，置于 保存。所有中药饮片购于陕西兴盛德药业公司，经陕西中医药大学中药炮制教研室赵重博副教授鉴定为正品，符合 版中国药典一部相关规定；葡聚糖硫酸钠（，货号：）购于美国 公司，分子量 ；粪便隐血试纸，购自安徽深蓝医疗科技股份有限公司。仪器 型电子天平（德国 公司）；正置光学显微镜、成像系统（日本尼康公司）；包埋机（武汉俊杰电子有限公司）；组织脱水机、病理切片机（上海徕卡仪器有限公司）。方法 造模、分组与给药小鼠适应性喂养 后随机分成正常组（）、模型组（）、黄芩汤低、中、高剂量组（、，、），葛根芩连汤低
9、、中、高剂量组（、，、），共 组，每组 只。正常组饮用纯净水，其余 组连续 自由饮用 水溶液诱导小鼠 模型。在造模的同时，黄芩汤、葛根芩连汤给药组以灌胃的方式连续给药 。实验过程中根据实际消耗量每天新鲜配制 水溶液。小鼠的一般情况及 评分实验期间每天固定时间检测小鼠的的精神状态、毛发、体质量、粪便的性状及粪便便血程度。评分按照等方法进行，即 评分 （体质量下降分数 粪便性状分数 便血分数），见表。标本取材与制备 治疗第 收集各组小鼠新鲜粪便，并保存于 冰箱中。在第 时，各组小鼠被处以安乐死，收集结肠整段，同时记录结肠长度，取远端结肠 长的部分在 多聚甲醛中固定。表 疾病活动指数评分体重下降（）
10、大便性状大便出血评分（分）正常正常（）隐血阳性（）松散轻微血便（）肉眼血便（）稀便显性出血（）苏木精伊红（）染色 结肠组织在 多聚甲醛中固定 以上，依次进行脱水、石蜡包埋、切片、脱蜡、苏木精伊红染色，最后在光学显微镜下观察结肠组织损伤情况。测序技术对样本中肠道菌群进行检测以及分析小鼠粪便样品 检测由北京诺禾致源科技股份有限公司完成，使用上游引物（）和下游引物（）对细菌的 段进行 扩增。产物经纯化、定量和均一化后，进行文库构建，构建好的文库经过 和 定量，文库合格后，使用 进行上机测序。统计学方法 所有定量数据以均数 标准差（），采用 软件进行数据分析与图形绘制，两组间比较采用 检验，多组间比较
11、采用单因素方差分析（），.为差异具有统计学意义。结果 两种复方对 小鼠一般性状及 的改善作用 一般状态观察实验期间，正常组小鼠状态良好、毛发光滑有光泽、饮食饮水量和粪便情况正常；与正常组比较，模型组小鼠自造模第 起，小鼠精神倦怠乏力、毛色黯淡无光泽、饮食饮水量减少、出现不同程度大便稀溏、便血情况。给药组经过黄芩汤和葛根芩连汤治疗后，小鼠精神状态出现明显好转，活动量增加，饮食饮水量也有所增加，粪便性状逐渐成形，便血情况也有所改善。小鼠的体重及疾病活动指数实验期间，正常组小鼠体质量呈上升趋势，模型组小鼠自造模第 起，体质量较正常组显著下降（陕 西 中 医 药 大 学 学 报 年 月第 卷第 期 .
12、）；黄芩汤中、高剂量组，葛根芩连汤中、高剂量组小鼠较模型组小鼠体质量均有明显改善（）（图）。评分显示，与正常组比较，模型组自第 起 评分显著升高（），黄芩汤中、高剂量组与葛根芩连汤中、高剂量组 评分降低（）；其中，黄芩汤中剂量效果优于葛根芩连汤中、高剂量组（图）。注：黄芩汤低、中、高剂量组与葛根芩连汤低、中、高剂量组对小鼠体质量变化的影响；黄芩汤低、中、高剂量组与葛根芩连汤低、中、高剂量组对小鼠疾病活动指数（）评分；与正常组比较，.，；与模型组比较，图 小鼠体重及疾病活动指数 两种复方治疗 小鼠后结肠长度及组织病理学观察 结肠长度变化与正常组比较，模型组小鼠结肠长度显著缩短（）；与模型组比较，
13、黄芩汤中、高剂量组与葛根芩连汤中剂量组均具有统计学意义（）（图），其中以黄芩汤中剂量效果最好。结肠组织病理学观察 正常组小鼠肠壁粘膜上皮细胞完整、无溃疡，固有层无炎细胞浸润，其它各层未见明显病变。与正常组相比，模型组小鼠大量炎症细胞浸润至结肠粘膜下层，隐窝缺失、表面可见变性坏死不完整的上皮细胞。与模型组比较，黄芩汤低、中、高剂量组、葛根芩连汤低、中、高剂量组均有不同程度的改善。其中，黄芩汤中、高剂量与葛根芩连汤中、高剂量有减轻肠壁粘膜炎症和溃疡的作用（图）。注：与正常组比较，；与模型组比较，。图 各组小鼠结肠长度注：正常组；模型组；黄芩汤低剂量组；黄芩汤中剂量组；黄芩汤高剂量组；葛根芩连汤低剂
14、量组；葛根芩连汤中剂量组；葛根芩连汤高剂量组图 各组 小鼠结肠组织病理切片结果（，）年 月第 卷第 期陕 西 中 医 药 大 学 学 报 两种复方治疗 小鼠后肠道菌群测序结果 物种注释与评估 为了评估测序物种的深度和丰富度，稀疏化处理了每个样本。群落覆盖度（）稀释曲线分析结果可见（图），随着测序量的增加，曲线趋于平坦，表明测序深度足够，大部分菌群已被检测到。小鼠肠道菌群的主坐标分析（）是一种非约束性的数据降维分析方法，可用来研究样本群落组成的相似性或差异性。本研究通过 做图发现正常组与模型组菌群样本分布在不同区域，提示两组肠道菌群结构存在差异性，同组样品分布在相近区（图）。给药后，黄芩汤低、中
15、、高剂量组均靠近正常组区域，特别是黄芩汤中剂量组距离正常组最近，提示两组肠道菌群结构相似（图）。葛根芩连汤低、中、高剂量组，以低、中剂量距离正常组较近，提示葛根芩连汤低、中剂量与正常组肠道菌群结构相似（图）。图 群落覆盖度（）稀释曲线分析结果注：组 分析；黄芩汤不同剂量组 分析；葛根芩连汤不同剂量组 分析图 小鼠肠道菌群的主坐标分析 两种复方对 小鼠肠道菌群的影响 将门、属两个水平上的序列数目与总序列数目进行统计分析，评估每个组在门水平和属水平的物种组成分析（图，）与物种差异分析（图，）。在门水平上，与正常组比较，模型组变形菌门（）、蓝细菌门（）、的相对丰度显著增加，拟杆菌门（）、厚壁杆菌门（
16、）、放线菌门（）相对丰度减少。与模型组比较，黄芩汤不同剂量组对厚壁杆菌门、变形菌门、放线菌门等菌门的丰度均有回调作用；其中，黄芩汤低、中、高剂量组显著回调了，中、高剂量组显著回调了 的丰度，中剂量组显著回调了陕 西 中 医 药 大 学 学 报 年 月第 卷第 期 蓝细菌的丰度。与模型组比较，葛根芩连汤不同剂量组对蓝细菌门、拟杆菌门、厚壁杆菌门、放线菌门的相对丰度均有回调趋势；其中，葛根芩连汤低剂量显著回调了变形菌门、的相对丰度。注：门水平物种组成分析；属水平物种组成分析；门水平物种差异分析；属水平物种差异分析图 各组小鼠肠道菌群门、属水平物种组成分析与物种差异分析 从门水平的结果可以看出黄芩汤与葛根芩连汤在改善 小鼠拟杆菌门、厚壁杆菌门、的相对丰度上均有一定的一致性。同时，两复方也有一定的差异性，主要表现在黄芩汤不同剂量组在调节、蓝细菌门的相对丰度明显优于葛根芩连汤不同剂量组；葛根芩连汤不同剂量组在调节变形菌门的相对丰度明显优于黄芩汤，以低剂量效果最为显著。在属水平上，与正常组比较，模型组副拟杆菌属（）、乳杆菌属（）、毛螺菌属（）、布劳特氏菌属（）、肠杆菌属（）的相对丰度呈降低趋势，大