1、收稿日期:20220614修回日期:20221125基金项目:国家自然科学基金项目(32060786、31660723);贵州省科技计划项目(黔科合支撑 2021 一般 161 号);贵州省优秀青年科技人才项目(黔科合平台人才 2021 5646)作者简介:宋春(1994)，女研究方向:动物疫病Email:1061655121 qqcom通信作者程振涛(1979)，男，教授研究方向:动物病原病理Email:chengzhentao sohucom鸡毒支原体 PstS 蛋白的原核表达及其定位宋春1，杨美1，岳筠2，单春兰1，王开功1，3，程振涛1，3(1贵州大学动物科学学院，贵州 贵阳 5500
2、25;2贵州省动物疫病预防控制中心，贵州 贵阳 5500083;贵州大学贵州省动物疫病与兽医公共卫生重点实验室，贵州 贵阳 550025)摘要:通过 SOE-PC 技术获得 PstS 基因全长并克隆到 pCold，将重组表达载体 pCold-PstS 转化进 BL21(DE3)后经 IPTG诱导表达融合蛋白 PstS，将其纯化后免疫新西兰兔制备多克隆兔抗血清，提取鸡毒支原体总蛋白、膜蛋白和胞浆蛋白，通过Western blot 分析 PstS 蛋白的亚细胞定位结果表明，PstS 基因长度为 1 065 bp，其蛋白在氨基酸 931 之间存在跨膜区，pCold-PstS 经诱导表达获得融合蛋白
3、PstS(存在于细胞膜和胞浆中)，其约 43 ku 并具有较好的抗原性 PstS 蛋白是鸡毒支开放科学(资源服务)标识码(OSID)原体膜表面的免疫原性蛋白，可为进一步研究其生物学功能和基因工程疫苗提供依据关键词:鸡毒支原体;PstS 基因;原核表达;亚细胞定位中图分类号:S85262文献标识码:A文章编号:1671-5470(2023)03-0344-07DOI:1013323/jcnkijfafu(natsci)202303009Prokaryotic expression and localization of Mycoplasmagallisepticum PstS proteinSO
4、NG Chun1，YANG Mei1，YUE Jun2，SHAN Chunlan1，WANG Kaigong1，3，CHENG Zhentao1，3(1College of Animal Science，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China;2Guizhou Provincial Center forAnimal Disease Control and Prevention，Guiyang，Guizhou 550008，China;3Guizhou Key Laboratory of AnimalDisease and Veterina
5、ry Public Health，Guizhou University，Guiyang，Guizhou 550025，China)Abstract:The full length of PstS gene was firstly amplified by SOE-PC and cloned into expression vector pCold Then the vectorpCold-PstS was transformed into BL21(DE3)to express the fusion protein PstS by IPTG induction，based on which p
6、olyclonal rabbitanti-serum was generated by immunizing New Zealand rabbit with the purified PstS protein The total protein，membrane protein andcytoplasmic protein of Mgallisepticum were extracted to analyze the distribution of PstS by Western blot with the rabbit anti-serumThe PstS gene was 1 065 bp
7、 in length，and its encoded protein had a transmembrane region between amino acid 9 and 31 The re-combinant protein PstS obtained by the induced expression of pCold-PstS was about 43 ku in size and had good antigenicity ThePstS existed on the membrane and in the cytoplasm of Mgallisepticum To summari
8、ze，PstS was an immunogenic protein on themembrane of Mgallisepticum，which provided theoretical support for further research on its biological function and genetic engineer-ing vaccineKey words:Mycoplasma gallisepticum;PstS gene;prokaryotic expression;subcellular localization鸡毒支原体(Mycoplasma gallisep
9、ticum，MG)是鸡慢性呼吸道疾病的重要病原，导致鸡呼吸困难甚至发生肺炎，阻碍鸡的生长发育，降低产蛋量，也会引起死胚率升高12 养禽业集约化养殖模式和管理不善等多种原因导致鸡毒支原体、传染性喉气管炎等呼吸道疾病普遍发生，多种病原混合感染并长期存在，严重危害禽业经济34 目前，控制 MG 感染的疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗在一定程度上，灭活疫苗可以控制感染，减少发病鸡的数量，降低产蛋量损失，但无法抵抗强毒株的攻击5 有研究表明，弱毒疫苗 F 株、6/85 和 ts-11 可有效控制 MG 在鸡体内传播68 但是弱毒疫苗免疫鸡群必须为健康鸡群，且蛋鸡在产蛋福建农林大学学报(自然科学版)第 52
10、卷 第 3 期Journal of Fujian Agriculture and Forestry University(Natural Science Edition)2023 年 5 月期不宜接种，这限制了弱毒疫苗的使用9 鸡毒支原体缺乏细胞壁结构，脂质相关膜蛋白在其膜表面大量存在，可介导支原体黏附、侵入宿主细胞等过程，决定了支原体致病性强弱10 所以 MG 膜蛋白筛选及其黏附特性研究是解析 MG 致病机理和亚单位疫苗靶标的关键如 TM-1 蛋白、PvpA 蛋白、烯醇化酶、醛缩酶、pMGA 蛋白等 MG 外膜蛋白均有研究报道1112 本试验基于 MG F 株基因组，分析磷酸盐 ABC 转运
11、蛋白底物结合蛋白(phosphate ABC transport-er substrate-binding protein，PstS)具有跨膜结构和良好的 B 细胞抗原表位，可能是 MG 的膜蛋白早期研究表明，PstS 是结核分支杆菌的膜蛋白，将其免疫小鼠后，可刺激细胞产生高水平的特异性抗体和 Th1 型细胞因子 IL-2、IFN-，具有较强的保护效率13 PstS 抗原是结核分支杆菌血清学诊断的最佳单抗原14 有研究表明，PstS 蛋白参与癌症、细菌和病毒感染等许多致病性相关的过程1516 但关于 PstS 蛋白在 MG 中的生物功能相关研究未见报道，本试验通过原核表达重组蛋白 PstS 制
12、备多克隆抗体，并应用 Western blot 对PstS 蛋白在 MG 内的分布进行定位分析，为进一步研究 MG PstS 蛋白的生物功能提供依据1材料与方法11菌株MG F 菌株购自中国兽医监察所;感受态 DH5 购自宝生物工程(大连)有限公司;BL21(DE3)购自江苏科晶生物科技有限公司12主要试剂改良 Frey 氏培养基购自中海生物科技有限公司;pMD-19T 载体、pCold表达载体由贵州大学动物科学学院提供PfuDNA Polymerase、限制性内切酶 Sal、BamH购自宝生物工程(大连)有限公司;His 标签蛋白纯化试剂盒购自 NOVAGEN 公司;BCA 蛋白定量试剂盒、
13、过硫酸铵、5SDS 蛋白上样缓冲液、预染蛋白 Marker、SDS-PAGE 凝胶快速配制试剂盒、DAB 显色液均购自上海碧云天生物技术有限公司;膜蛋白提取试剂盒购自上海贝博生物公司;弗氏佐剂、羊抗兔标记抗体(HP-IgG)均购自 SIGMA 公司13PstS 蛋白的生物信息学分析选择 15 株鸡毒支原体 NC06、NC08、NC95、NC96、VA94、S6、NY01、StrF、Str(high)、Str(low)、F、f99lab、NCTC、W101、CA06 参考菌株序列，应用相关软件17 分析 MG F 株 PstS 基因(AHB993661)的保守性、色氨酸密码子(TGA)，PstS
14、 蛋白序列的理化性质、亲/疏水区、跨膜区、信号肽、B 细胞表位14PstS 基因的 SOE-PC 扩增与克隆MG 使用改良 Frey 氏培养基进行培养，提取其基因组为模板PstS 基因在 210 和 1 017 bp 处存在 2 个TGA 密码子，在大肠杆菌中表达为终止密码子，本试验利用 SOE-PC 将 2 个 TGA 点突变改变为编码色氨酸的 TGG根据 GenBank 上已发表的鸡毒支原体 StrF(CP0018731)中 PstS 基因信息，设计特异引物(表1)，利用 PstS p1/p2 扩增 PstS 的基因片段 231 bp，PstS p3/p4 扩增 849 bp，将 2 个
15、TGA 突变成 TGG，按照条件 94 3 min、94 30 s、60 30 s、72 2 min、30 个循环、72 延伸 5 min 进行 PC 反应经凝胶电泳并回收 2 个片段为模板，PstS p1/p4 引物扩增 PstS 基因1 065 bp按照条件 94 3 min、94 30 s、58 1 min、72 20 s、30 个循环、72 延伸7 min 进行 PC 扩增扩增 PstS 基因全长后回收并克隆至 pMD-19T载体，构建正确的克隆质粒 pMD-PstS表 1PstS 基因引物序列1)Table 1Primer sequences for PstS genePstS 基因
16、引物名称引物序列 53预扩增片段bp片段 1PstS-p1CAGGGATCCATGAATACAAGGGGTTC231PstS-p2AGTCTTGATCTCAAGATCTTTCCATTGTTGAGTAGTTCTAGG片段 2PstS-p3CTTGAGATCAAGACTGTTGCTTTAGCTAAAGATGCAATCGCAG849PstS-p4CGGGTCGACTTAGAATTCAACCCCAAATTTAACTGGATTAAATGAAAAGTCACTAACCC1)下划线部分为限制性内切酶 BamH(GGATCC)、Sal(GTCGAC)序列，下划双线部分为点突变位点543第 3 期宋春等:鸡毒支原体 PstS 蛋白的原核表达及其定位15pCold-PstS 原核表达载体的构建将 pMD-PstS、pCold表达载体用 BamH、Sal进行双酶切后，经 10%琼脂糖凝胶电泳鉴定并胶回收 PstS 基因和 pCold载体大片段，然后进行连接、转化至 BL21(DE3)感受态细胞，于 LB 固体平板(Amp+)培养，挑单菌落于 LB 液体(Amp+)培养，提取重组质粒经 PC、双酶切鉴定后送生工