1、*食源性疾病监测*福建省福州市食源性疾病暴发事件副溶血弧菌基因组遗传特征分析李钰娴1,2,3，刘秀峰2,3，陈凡冰2,3，陈智伟2,3，叶海梅2,3，潘洁茹2,3，刘杰2,3摘要：目的获得福建省福州市四起暴发事件分离的副溶血弧菌序列分布特点，并分析不同菌株间遗传关系。方法对 19 株副溶血弧菌进行全基因组序列测定，使用相应的生物信息学软件对测序数据进行基因组装和基因预测，借助相关数据库获得不同菌株的多位点序列分型、耐药基因和毒力基因情况，采取最大似然法构建系统发育树。结果19 株副溶血弧菌依据 7 个管家基因分型，得到4 种序列型（ST），其中ST3 为优势型，1 株菌暂定为未知型。全部菌株均
2、携带-内酰胺类和四环素类抗生素耐药基因，同时携带影响宿主细胞致病力的重要毒力基因。2 种喹诺酮类耐药基因和 trh 毒力基因仅在 F265 菌株中检出。全基因组系统发育树进化分析结果显示，暴发菌株被分成 3 个进化分支，E2019、E2020-1 和 E2020-2 的菌株主要集中在 lineageB 进化分支，E2018 的菌株均在 lineageC进化分支。结论四起暴发事件由 ST3 克隆复合体主导，并伴随其他 ST 型别菌株的影响。同起暴发事件分离菌株具有遗传多样性，菌株测序数据为暴发事件溯源提供技术支持。关键词：副溶血弧菌；暴发；全基因组测序；多位点序列分型；系统发育树中图分类号:R2
3、11;R378.3文献标志码:A文章编号:10039961（2023）05054806GenomiccharacteristicsanalysisonVibrioparahaemolyticusisolatedfromfood-bornediseasesoutbreaksinFuzhou,FujianprovinceLi Yuxian1,2,3,Liu Xiufeng2,3,Chen Fanbing2,3,Chen Zhiwei2,3,Ye Haimei2,3,Pan Jieru2,3,Liu Jie2,3.1.School ofPublic Health,Fujian Medical Uni
4、versity,Fuzhou 350122,Fujian,China;2.Fuzhou Municipal Center for Disease Controland Prevention,Fuzhou 350004,Fujian,China;3.Fuzhou Municipal Center for Disease Control and Prevention,FujianMedical University,Fuzhou 350004,Fujian,ChinaCorresponding authorCorresponding author:Liu Xiufeng,Email:Abstrac
5、t:ObjectiveToobtainthesequencedistributioncharacteristicsofVibrio parahaemolyticusstrainsisolatedfromfouroutbreaksinFuzhou,Fujianprovince,andanalyzegeneticcorrelationsamongdifferentstrains.MethodsThe19strainsofV.parahaemolyticusweresequencedwithwholegenomesequencing(WGS).Genomeassemblyandgenepredict
6、ionforsequencedstrainswereperformedusingcorrespondingbioinformaticssoftware.Multilocussequencetyping,antibioticresistancegenesandvirulencegenesoftheV.parahaemolyticusstrainswerediscoveredusingrelevantdatabases.Thephylogenetictreewasconstructedbythemaximumlikelihoodmethod.ResultsThe19V.parahaemolytic
7、usstrainswereclassifiedintofoursequencetypesaccordingtosevenhousekeepinggenes,ST3wasthepredominantSTsandtherewas1strainbelongedtoanunknownST.Allthestrainscontained-lactamandtetracyclineantibioticresistancegenes,andcarriedimportantvirulencegenescausingpathogenicityofhostcells.Twoquinoloneresistancege
8、nesand1trh+virulencegeneweredetectedonlyinF265strain.Thephylogenetictreeevolutionanalysisshowedthatthestrainsisolatedintheoutbreakscouldbedividedintothreeevolutionaryclades,withstrainsE2019,E2020-1,andE2020-2mainlyinlineageBevolutionarybranchandstrainsE2018allinlineageCevolutionarybranch.ConclusionT
9、heV.parahaemolyticuscausingthefouroutbreakswerepredominatedbyST3clonalcomplexaccompaniedbyotherSTs.Thestrainsisolatedfromthesameoutbreakshowedgeneticdiversity.Thesequencingdataprovidedtechnicalsupportforsourcetracingoftheoutbreaks.Keywords:Vibrio parahaemolyticus;Outbreak;Wholegenomesequencing;Multi
10、locussequencetyping;PhylogenetictreeThisstudywassupportedbythefundforFuzhouScienceandTechnologyProgramofFujianProvince(No.2019-SZ-64)副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus，VP）是革兰阴性嗜盐菌，广泛存在于海水、海水产品和海底沉积物，是引起食物中毒的重要病原菌。该微生物常在贝壳类动物、鱼虾等检出率比较高13，容易通过生的或未熟的海鲜产品进入人体，导致人体出现腹泻、恶心、呕吐等临床症状。据相关研究报道，胃肠 炎 疾 病 感 染 与 VP 携 带
11、 耐 热 直 接 溶 血 素（thermostabledirecthemolysin，TDH）、耐热相关溶血素（thermostabledirectrelatedhemolysin，TRH）和三型分泌系统（type3secretionsystem，T3SS）等毒力因子有关45。VP 主要通过水平基因转移（horizontalgene基金项目：福建省福州市科技计划项目（No.2019-SZ-64）作者单位：1.福建医科大学公共卫生学院,福建福州350122；2.福州市疾病预防控制中心,福建福州350004；3.福建医科大学附属福州市疾病预防控制中心,福建福州350004作者简介：李钰娴，女，广西
12、壮族自治区北流市人，在读研究生，主要从事病原微生物检验工作，Email:通信作者：刘秀峰，Tel：059183313524，Email：收稿日期：20220712网络出版日期：20230426548疾病监测2023年5月30日第38卷第5期DISEASESURVEILLANCE,May30,2023,Vol.38,No.5www.jbjc.orgDOI:10.3784/jbjc.202207120318transfer，HGT）机制和频繁基因重组事件，导致自身遗传物质发生变化67。在探究 VP 遗传进化特征技术手段中，全基因组测序技术（whole genomesequencing，WGS）由于
13、能够获得细菌几乎所有的基因组基本信息，因而在研究细菌的变异和暴发溯源等方面具有显著优势8。如 Haendiges等9通过基因组数据分析发现马里兰州（20122013 年）区域的 ST36 与新西海岸新 ST36 遗传关系密切，而不是西海岸历史的 ST36。通过对福州市 20182020 年四起食源性疾病暴发事件的分离菌株进行全基因组序列测定，使用基因组序列信息进行多位点序列分型（multilocussequencetyping,MLST）分型和聚类分析，了解VP 基因组特征。1材料与方法1.1材料1.1.1实验菌株从暴发事件临床患者的粪便样本分离到 19 株 VP（表 1），包括 2018 年
14、暴发事件（E2018）分离株 4 株（F51F54），2019 年暴发事件（E2019）分离株 5 株（F163F167），2020 年暴发事件（E2020-1 和 E2020-2）分离株 10 株（分别为 F263F268 和 F312F315）。1.1.2试剂和仪器弧菌显色培养基（法国 CHROMagar）；碱性蛋白胨水、TCBS 琼脂培养基和营养琼脂培养基（北京陆桥技术有限责任公司）；VITEK2GN 革 兰 阴 性 菌 鉴 定 板、浊 度 仪 和 VITEK 2Compact 全自动微生物鉴定仪（法国梅里埃公司）；NGSmaster 小体积人细胞总核酸提取试剂盒、NGS 文库定量试剂盒
15、和全自动核酸提取纯化仪（杭州杰毅生物技术有限公司）；IlluminaMiniSeq测序仪、IlluminaMiniSeq测序试剂盒（美国 Illumina 公司）；Quantstudio5 荧 光 定 量 扩 增 仪（美 国 AppliedBiosystems 公司）。1.2方法1.2.1VP 的分离、培养和鉴定参照 WS/T811996副溶血性弧菌食物中毒诊断标准及处理原则进行分离培养操作，经过实时荧光扩增仪、全自动微生物鉴定仪和相应生化实验鉴定。1.2.2全基因组测序实验1.2.2.1文库构建从 TCBS 平板和弧菌显色平板上，挑选满足 VP 要求的单个菌落，接种划线于营养琼脂平板 36
16、培养 24h，刮取菌苔悬于 1mL 无菌生理盐水，测得浊度范围为 0.61.0MCF（麦氏浊度单位），按照 NGSmaster 小体积人细胞总核酸提取试剂盒说明书，进行试剂盒加样操作，应用全自动核酸提取纯化仪，提取 VP 的 DNA 文库。试剂盒反应体系：40L 纯化磁珠，400L 前处理后待测样本，600L裂解液（已加异丙醇），20L 蛋白酶 K，1600L 无水乙醇，30L 接头，5L 补平片段酶，10L 补平片段化缓冲液。1.2.2.2DNA 文库定量与全基因组测序按照NGS 文库定量试剂盒说明书，配制荧光定量扩增仪反应的 10L 体系（QuantFastSYBRGreenqPCRSuperMix5L，PrimerPremix1L，10 倍稀释文库/100 倍稀释文库/标准品 4L），将配制的反应体系放入荧光定量扩增仪中，并按相应流程操作。扩增程序：95 预变性 3min，95 变性 5s，62 退火 45s。定量实验结果满足：斜率：3.13.6，相关系数0.99，扩增效率：90%110%，阴性对照读数为 0 或未检出。将满足定量实验结果的文库样品预pooling 计算，最后，经