1、宁夏医科大学学报45卷脑卒中分为缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中出血性脑卒中占全部脑卒中的 15%左右1。尽管脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）发病率低于脑缺血，但其更高的病死率和致残率值得高度重视2。ICH 通常表现为脑内动脉突然破裂，血液释放压迫周围脑组织，引起颅内压迅速升高，继而导致脑水肿，导致炎症、氧化应激的发生和血脑屏障破坏3-4。当前对于 ICH 的治疗主要体现在手术清除血肿、药物止血以及调节血压5，但疗效以及预后仍不理想，给患者以及社会带来沉重的负担6。因此，探寻理想的 ICH 治疗手段仍是当前研究者面临的一项挑战。间充质干细胞（mesenchym
2、al stem cells，MSCs）因其具有自我更新、免疫原性低、多向分化潜能及免疫调节等生物学特性7，已被应用于治疗多种疾病的动物模型中，例如 ICH8、脑缺血9、脊髓损伤10、糖尿病11、关节炎等12，并展现出良好的治疗效果。MSCs 对 ICH 具有一定的治疗作用13，但是对于 ICH 这类神经系统损伤的疾病，移植神经干细胞（neural stem cells，NSCs）对神经系统的损伤修复可能更精准、更高效14-15。内源性 NSCs 来源有限，不能满足临床移植所需，且不易对其标准化制备16。研究17-18发现，MSCs 具备在一定条件下能被诱导分化为 NSCs 的潜能，这将为解决N
3、SCs 移植治疗 ICH 等疾病面临的细胞数量少、细胞标准化制备等难题提供新思路。本课题组前期已经将胎盘间充质干细胞（placental mesenchymal stem cells，pMSCs）在诱导培养基的作用下诱导生成神经干细胞（inducedneural stem cells，iNSCs）19，且 iNSCs 条件培养基具有良好的抗氧化特性，能够促进受损海马神经干细胞的修复20。因此，本研究将进一步探讨iNSCs 对 ICH 大鼠的神经保护作用。间充质干细胞诱导的神经干细胞对脑出血大鼠的神经保护作用刘佳鑫1，曹传尚1，金毅然1，马晓娜1，李家辉1，郭松林1，牛建国2，梁雪云1（1.宁夏
4、医科大学总医院，宁夏干细胞与再生医学重点实验室，银川750004；2.宁夏医科大学，宁夏颅脑疾病重点实验室，银川750004）摘要：目的探讨胎盘间充质干细胞（pMSCs）诱导的神经干细胞（iNSCs）对脑出血（ICH）大鼠的神经保护作用。方法利用诱导培养基将胎盘间充质干细胞诱导生成神经干细胞；采用免疫荧光染色鉴定诱导生成的神经干细胞表达神经干细胞相关标记物的情况。SD 大鼠随机分为假手术组（Sham 组）、脑出血组（ICH 组）、诱导的神经干细胞移植组（iNSCs 组），构建大鼠纹状体内囊出血模型，24 h 后，将诱导的神经干细胞原位移植入脑出血部位。移植 7 d 后，采用前肢放置实验、转角实
5、验、改良型神经功能缺损评分等方法评估各组的神经功能；评估各组大脑血肿体积率；采用 HE 及尼氏染色观察各组大脑组织形态变化；采用免疫荧光双标染色观察各组神经元 Cleaved-Caspase-3 表达情况；采用 Western blot 检测各组大脑组织超氧化物歧化酶（superoxidedismutase，SOD）蛋白表达水平。结果胎盘间充质干细胞诱导培养 7 d 后，有大量直径 100 m 左右、桑葚样或圆球体形的细胞球出现，细胞球中 Nestin、GAP-43、Sox-2 等神经干细胞标记物高表达。与 ICH 组比较，iNSCs 组的神经功能障碍改善，且大脑血肿体积率降低（P 均0.05
6、）。HE 及尼氏（Nissl）染色结果显示，iNSCs组大脑血肿周围的炎细胞浸润数目较 ICH 组减少，同时，iNSCs 组神经元数量增加（P0.05）。免疫荧光双标染色结果显示，与 ICH 组比较，iNSCs 组大脑血肿周围 Cleaved-Caspase-3 阳性神经元数目减少（P0.05）；Western blot 结果显示，iNSCs 组 SOD 蛋白水平高于 ICH 组（P0.05）。结论胎盘间充质干细胞诱导的神经干细胞移植可能通过提高大脑抗氧化能力，减少脑出血大鼠神经元凋亡，进而促进脑出血大鼠的神经损伤修复。关键词：胎盘间充质干细胞；诱导的神经干细胞；脑出血；神经保护中图分类号：R
7、651.1文献标识码：ADOI：10.16050/ki.issn1674-6309.2023.04.002收稿日期：2022-10-24基金项目：宁夏自然科学基金项目（2022AAC02068）；宁夏回族自治区重点研发项目（2021BEG03098）作者简介：刘佳鑫（1997），男，在读硕士研究生，研究方向：干细胞生物学。E-mail：通信作者：梁雪云（1973），女，研究员，硕士研究生导师，研究方向：干细胞生物学。E-mail：文章编号：1674-6309（2023）04-0332-08论著第 45 卷4 期2023 年 4 月宁夏医科大学学报Journal of Ningxia Medic
8、al University3324期1材料与方法1.1实验材料与试剂实验中所用 P3 代次的 pMSCs 由宁夏医科大学总医院宁夏干细胞与再生医学重点实验室提供，细胞的采集及获取获得宁夏医科大学总医院伦理委员会批准（伦理编号：2020-289）。实验所用的 SPF 级 SD 雄性大鼠（250280 g）购自宁夏医科大学实验动物中心，并按宁夏医科大学实验动物伦理规定进行操作。Neurobasal-A Medium、B-27 Supplement（50）、N-2 Supplement（100）、胰蛋白酶、GlutaMAXTMSupplement、磷酸缓冲盐溶液（PBS）购自美国 Gibco 公司；
9、UltraCULTURETMSerum-free Medium 购自瑞士 LONZA 公司；ultroser G 血清替代物（ultroser G serum substitute，UG）购自美国 PALL 公司；表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）、碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）购自美国PeproTech 公司；Heparin 购自加拿大 STEMCELL公司；层粘连蛋白包被液购自瑞典 BioLamina 公司；型胶原酶购自美国 Sigma-Aldrich 公司；兔抗 Sox-2、-actin
10、，山羊抗兔 CoraLiteR488 购自美国 Proteintech 公司；兔抗 GAP-43、超氧化物歧化酶（SOD），鼠抗 NeuN，山羊抗兔 Alexa FluorR555、H&L（HRP），山羊抗鼠 Alexa FluorR488 均购自英国 Abcam 公司；兔抗 Nestin 购自美国 Invitrogen 公司；兔抗 Cleaved-Caspase-3 购自美国Affinity 公司；A 型胶原酶购自瑞士 Roche 公司；异氟烷购自深圳市瑞沃德生命科技有限公司；尼氏染色试剂盒、HE 染色试剂盒、4%多聚甲醛、羊血清、含 DAPI 封片剂购自北京索莱宝科技有限公司；ECL 检测
11、试剂盒购自凯基生物公司；CO2恒温培养箱、PRIMO 台式高速离心机购自美国Thermo Fisher 公司；倒置显微镜购自日本 Olympus 公司；其他细胞培养皿、细胞培养板、细胞筛等耗材购自美国 Corning 公司。1.2方法1.2.1pMSCs 分离及培养pMSCs 采集方法沿用课题组前期研究21，简要描述如下：获取人源性胎盘母体侧组织，采用无菌操作方法将其剪碎，PBS 洗涤后用 0.1%的 A 型胶原酶于 37 水浴处理 2 h，每隔 20 min 颠倒混匀，并将消化后的细胞悬液通过 100 m 的细胞筛，离心并弃掉上清液，加入适量培养液，将细胞混合液转至培养皿中，于 37、5%C
12、O2培养箱中培养，待细胞密度至 80%左右进行传代。复苏 P3 代次的 pMSCs 并将其培养于添加了UG 的通用型无血清培养基（ultraculture serum-free medium）中，次日换液，待细胞密度达到 80%左右，传代扩增至 P5 代用于诱导神经干细胞。1.2.2iNSCs 诱导方法配制 iNSCs 诱导培养基，其比例分别为 Neurobasal-A Medium（97%）、B-27（2%）、N-2（1%）、bFGF（10 mgL-1）、EGF（20 mg L-1）、Heparin（2 mg L-1）。将细胞数为 2106的 P5 代 pMSCs 重悬于 10 mL 的 i
13、NSCs 诱导培养基中并接种在 100 mm 的细胞培养皿悬浮诱导，每 3 d 向培养皿中补充 3 mL 的诱导培养基，只补液不弃液。1.2.3iNSCs 及 pMSCs 的免疫荧光染色鉴定复苏 P5 代次的 pMSCs，以及在诱导后第 7 天，收集直径在 100 m 左右的 iNSCs，将其轻柔吹散成单个细胞，将上述细胞接种在预先用层粘连蛋白包被的 12 孔板中，过夜培养，待次日细胞贴壁后，弃掉培养液，PBS 清洗 2 遍，用 4%的多聚甲醛室温固定细胞 20 min，加入 0.5%Triton X-100室温破膜 20 min，再用 5%的羊血清室温封闭 1 h后，分别与以下一抗，即 Ne
14、stin（1200）、GAP-43（1500）、Sox-2（1500）于 4 孵育过夜。次日用PBS 清洗 3 次，每次 10 min，然后分别加入荧光二抗 Alexa FluorR555（1500）或 CoraLiteR488（1500）室温避光孵育 2 h。加入 DAPI 染液对细胞核染色，并在荧光显微镜下观察采集图像。每组蛋白鉴定设置 3 个复孔，每个样本孔随机拍摄 5个视野，计算阳性细胞率，最后再计算出各组蛋白阳性细胞率的均值。1.2.4大鼠 ICH 模型将大鼠随机分为假手术组（Sham 组）、脑出血组（ICH 组）和诱导的神经干细胞移植组（iNSCs 组），每组 10 只。用异氟烷麻
15、醉大鼠，将其固定在手术台面，备皮，碘伏消毒，沿两眼中点做矢状切口暴露前囟，以前囟为坐标原点，向后 0.2 mm，向左旁开 3.0 mm，深度 6.0 mm 为左侧纹状体内囊定位点，用微量注射器以 0.4 L min-1的速率缓慢注射 2 L 的型胶原酶（0.2 U）。注射结束需停针 10 min，垂直缓慢拔出针头，并用骨蜡封闭针孔以及缝合伤口。ICH 模型以注射型胶原酶 24 h 完成，Sham组在不注射胶原酶的情况下进行相同的操作。1.2.5iNSCs 原位移植将 iNSCs 用胰酶预处理5 min 后，用培养基终止消化并轻柔吹打，使其成为单个细胞。大鼠麻醉、固定及纹状体定位同ICH 造模方
16、法。当型胶原酶注射 24 h 后，将 1刘佳鑫，等.间充质干细胞诱导的神经干细胞对脑出血大鼠的神经保护作用333宁夏医科大学学报45卷106/30 L 的 iNSCs 用量程为 100 L 微量注射器原位缓慢注射到 ICH 大鼠左侧纹状体内囊，退出针头，并用骨蜡封闭针孔以及缝合伤口。Sham组和 ICH 组注射等体积的 PBS，其他操作相同。1.2.6神经功能评估1）前肢放置实验：用于评估动物的感觉运动功能障碍，实验前，让动物放松，轻柔抓住大鼠使其四肢自由悬空，让大鼠的右侧胡须触碰桌角，诱导其将前肢放置于桌面，大鼠发生 ICH 后，会对侧前肢放置呈现一定障碍，每只大鼠测试 10 次，记录大鼠右侧前肢放置成功的百分率反映动物的损伤情况。分值越高，代表动物损伤情况相对越小。2）转角实验：用以评估动物的肢体协调功能的损伤情况，将大鼠置于由两块挡板形成的 30夹角装置中，大鼠会转身，每只大鼠测试 10 次，记录大鼠右转的百分率，每次测试间隔30 s。分值越高，代表动物损伤情况相对越小。3）改良神经功能缺损评分（modifiedneurologicalseverityscore，mNSS）：用以