1、第三章细胞工程的技术(jsh)基础,第一页，共四十八页。,2,第一节基本设备(shbi)第二节基本技术,第二页，共四十八页。,3,第一节基本(jbn)设备,一设备(shbi)与器材二器材处理,第三页，共四十八页。,4,一、设备与器材 大型设备类：无菌室、超净工作台、无菌箱、CO2培养箱、倒置显微镜、实体镜、高速(o s)离心机、超速低温离心机、冰箱、超低温冰箱、液氮装置。,第四页，共四十八页。,5,第五页，共四十八页。,6,第六页，共四十八页。,7,培养箱,第七页，共四十八页。,8,第八页，共四十八页。,9,第九页，共四十八页。,10,光照(gungzho)培养室,第十页，共四十八页。,11,
2、第十一页，共四十八页。,12,显微镜室,第十二页，共四十八页。,13,第十三页，共四十八页。,14,第十四页，共四十八页。,15,第十五页，共四十八页。,16,第十六页，共四十八页。,17,第十七页，共四十八页。,18,第十八页，共四十八页。,19,第十九页，共四十八页。,20,消毒灭菌设备：蒸汽压力消毒器、电热干燥箱、过滤除菌装置、离子发生器、耐酸(nai sun)耐碱容器、吸管自动冲洗器、超声波清洗器；,第二十页，共四十八页。,21,灭菌(mi jn)室,第二十一页，共四十八页。,22,第二十二页，共四十八页。,23,第二十三页，共四十八页。,24,第二十四页，共四十八页。,25,第二十五
3、页，共四十八页。,26,配液用具：水纯化装置、离子交换树脂装置、电子天平、磁力搅拌器、蒸发器等；制备、培养、保存细胞用品：解剖(jipu)器具、80200目尼龙网或不锈钢网、血细胞计数板、培养器皿、细胞培养板（不同孔数）、涡流混悬器、恒温水浴振荡器、细胞冻存管、玻璃安瓿、真空低温干燥器、厚质玻璃容器等。,第二十六页，共四十八页。,27,第二十七页，共四十八页。,28,第二十八页，共四十八页。,29,第二十九页，共四十八页。,30,第三十页，共四十八页。,31,第三十一页，共四十八页。,32,第三十二页，共四十八页。,33,第三十三页，共四十八页。,34,第三十四页，共四十八页。,35,第三十五
4、页，共四十八页。,36,二、器材(qci)处理,玻璃器皿的清洗：浸泡刷洗浸酸冲洗 橡胶用品的处理：冲洗碱煮冲洗浸酸冲洗蒸煮清洗除菌滤器的处理：高压灭菌塑料器皿的清洗：冲洗碱浸冲洗酸浸冲洗漂洗金属器械的清洗：汽油去脂洗净酒精擦蒸煮或高压灭菌包装：包装纸、牛皮纸、硫酸纸、棉布、铝饭盒(fnh)、玻璃等，避免消毒后再污染；消毒灭菌：干烤、高压蒸汽灭菌、滤过除菌、紫外线、射线、（甲醛）熏蒸消毒、化学消毒剂、抗生素消毒灭菌。,第三十六页，共四十八页。,37,一、无菌技术1.各种灭菌方法(fngf)及其适用范围A湿热灭菌法（高压蒸汽灭菌法、常压蒸汽灭菌法、间歇灭菌法）B 干热灭菌法（火焰灭菌、干热灭菌）C
5、电离辐射灭菌D 紫外线杀菌E过滤除菌F化学杀菌G熏蒸灭菌法,第二节基本(jbn)技术,第三十七页，共四十八页。,38,2.无菌操作过程A 清洗(qngx)玻璃器皿的清洗 实验材料的清洗B 灭菌 培养材料的灭菌以药剂灭菌法为主主要考虑：药剂的灭菌效果、材料对药剂的耐受力,第三十八页，共四十八页。,39,第三十九页，共四十八页。,40,第四十页，共四十八页。,41,培养基灭菌高压蒸汽灭菌过滤灭菌C 接种经过表面灭菌的材料，按不同(b tn)的要求，经过剪切、整理后，移植到培养基上培养的过程。接种室（无菌操作室）的灭菌接种台的灭菌工作人员注意事项,第四十一页，共四十八页。,42,3.实验室生物安全概
6、念：指那些用以防止(fngzh)发生病原体或毒素无意中暴露及意外释放的保护原则、技术及实践。传染性微生物的危险程度分4级1级、2级、3级、4级生物安全水平（BSL）相应的也分为4级BSL 1（基础实验室）BSL 2（基础实验室）BSL 3（防护实验室）BSL 4（最高防护实验室）,第四十二页，共四十八页。,43,二、细胞制备：机械分散法 淋巴细胞分离：肝素抗凝血剂+Hanks 稀释 分级分离 吸取 加其它培养液单细胞悬 胰蛋白酶 细胞 T、B细胞分离：尼龙棉柱过滤(gul)B细胞粘附 液的制备 酶消化法 分离法 T细胞过滤 胶原酶 CD4/CD8细胞分离：SephadaG-10柱或 流式细胞分
7、选仪 螯合剂分散法 单核/巨噬细胞分离淋巴细胞不粘，（与玻面粘附）单核/巨噬细胞粘附,第四十三页，共四十八页。,44,三、细胞计数法：血细胞计数板或器 细胞分装；四、细胞培养与传代五、细胞形态学检查法：一般形态观察利用倒置(dozh)显 普通染色观察（Giemsa染核）微镜观察法 特殊染色法：DNA（Feulgen反应）、DNA-RNA（甲基-派洛宁）、糖（PAS）、脂（苏丹红II）、线粒体（詹纳斯绿B液）、叶绿体（吖啶橙）,第四十四页，共四十八页。,45,吖啶橙：DNA、RNA利用荧光显微镜观察法 扫描 免疫荧光染色 透射(tu sh)利用电子显微镜观察法：扫描或透射。六、无血清培养液的设计
8、和合成七、细胞的冻存、复苏与运输八、细胞培养的放大试验（生产）九、细胞培养时污染的检测、排除,第四十五页，共四十八页。,46,本章(bn zhn)内容到此结束,谢谢(xi xie)大家,欢迎(hunyng)研讨,第四十六页，共四十八页。,47,【复习思考题】常用的灭菌方法有哪几类？概述它们的原理。判断题：已经洗净的仪器可以用布或纸擦干。无菌操作一般要求在酒精灯火焰前10-20cm范围内进行。过滤除菌的适用(shyng)对象是易被高温破坏的材料如抗生素、糖、激素等试剂。,第四十七页，共四十八页。,内容(nirng)总结,第三章。玻璃器皿的清洗：浸泡刷洗浸酸冲洗。橡胶用品的处理：冲洗碱煮冲洗浸酸冲洗蒸煮。塑料器皿的清洗：冲洗碱浸冲洗酸浸冲洗漂洗。金属器械的清洗：汽油去脂洗净酒精擦蒸煮或高压灭菌。主要(zhyo)考虑：药剂的灭菌效果、材料对药剂的耐受力。经过表面灭菌的材料，按不同的要求，经过剪切、整理后，移植到培养基上培养的过程。BSL 1（基础实验室）。DNA-RNA（甲基-派洛宁）、。47,第四十八页，共四十八页。,