1、乙肝两对半测定(cdng)酶联免疫法,实习生：廖於波指导老师：李海龙(hi ln),第一页，共三十二页。,HBV是乙型病毒性肝炎的病原体。HBV感染呈世界性流行，但不同地区感染的流行程度差异很大。据WHO报道，全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致(su zh)的肝衰竭、肝硬化和原发性肝细胞癌。我国属高流行地区一般地区HBsAg阳性率为7.18%。,第二页，共三十二页。,乙肝病毒血清(xuqng)标志物,HBsAg第一个出现，感染后1-2周即可阳性阳性表示存在HBV感染HBsAb出现在HBsAg消失后保护性抗体疫苗免疫成功(chnggng
2、)的标志,第三页，共三十二页。,乙肝病毒血清(xuqng)标志物,HBeAg病毒(bngd)复制标志传染性强HBeAb 传染性降低长期存在是DNA与肝细胞整合的结果,第四页，共三十二页。,乙肝病毒血清(xuqng)标志物,HBcAg HBV复制的标志血清中难以检测出来(ch li)IgM-HBcAb 急性HBV感染IgG-HBcAb急性感染恢复期和慢性持续感染,第五页，共三十二页。,检测HBV病毒血清(xuqng)标志物是临床最常用的病原学诊断方法。HBV具有三个抗原抗体系统，即乙肝表面抗原（HBSAg）和乙肝表面抗体（HBsAb）、e抗原（HBeAg）和e抗体（HBeAb）、核心抗原（HBc
3、Ag）核心抗体（HBcAb），由于HBcAg在血液中难于检出，故临床免疫学检测不包括HBcAg，目前常采用酶联免疫法和化学发光法检测。,第六页，共三十二页。,酶联免疫吸附实验(shyn)原理,用于检测包被(bo bi)于固相板孔中的待测抗原（或抗体）。即用酶标记抗体，并将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相载体表面进行，用洗涤法将液相中的游离成分洗除，最后通过酶作用于底物后显色来判断结果。颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。,第七页，共三十二页。,乙肝病毒血清(xuqng)标志物检测原理,第八页，共三十二页。,标本(biobn)本要求,采集：血浆：使用抗凝血浆管
4、（枸橼酸盐、EDTA盐、肝素(n s)之一为抗凝剂）采集样品。样品离心分离后，提取血浆用于检测。血清：采用正确医用技术采集标本。离心分离后，提取血清样品用于检测。,第九页，共三十二页。,标本(biobn)要求,储存：样品可存放于28冰箱，24小时内测定。若需长时间保存，则应冻存于-20以下，避免反复冻融。上述样品使用前应恢复(huf)到室温，轻轻摇动混匀。若标本有沉淀物形成，应离心除去，并确定未变质方可使用。严重融血或脂血标本不可使用。,第十页，共三十二页。,试剂(shj)（安图生物）,主要组成(z chn)成分,第十一页，共三十二页。,实验(shyn)前准备,1.取出试剂盒及待测样品，将所有
5、试剂及样品恢复至室温（1825）。2.将恒温箱或水浴锅调至反应温度。3.洗液用蒸馏水作20倍稀释(xsh)后备用。,第十二页，共三十二页。,检验(jinyn)步骤,排板,第十三页，共三十二页。,检验(jinyn)步骤,表面抗原（两步法）1.留一孔作空白对照，加入样本稀释液20ul/孔（含空白孔），其他加入阴性对照三孔和阳性对照二孔100ul/孔及待测标本100ul/孔于相应的反应孔内。2.在微型真当器上振荡30秒使孔内液体混合均匀（该步骤非常(fichng)重要）。3.贴上板贴，置37下温育60分钟。,第十四页，共三十二页。,检验(jinyn)步骤,4.撕下板贴，除空白孔外，各孔加入(jir)
6、酶结合物50ul。5.在微型振荡器上振荡30秒使孔内液体混合均匀（该步骤非常重要）。6.贴上板贴，置37下温育30分钟。7.撕下板贴，洗板6次，最后在吸水纸上拍干。8.每孔加入底物液、显色剂各50ul，37避光温育30分钟。,第十五页，共三十二页。,检验(jinyn)步骤,9.加终止液50ul/孔，轻轻振荡混匀后，立即(lj)测试结果。10.使用酶标仪450nm单波长测量各孔的OD值。,第十六页，共三十二页。,检验(jinyn)步骤,表面抗体、e抗原、e抗体、核心抗体（一步法）1.留一孔空白，三孔加入(jir)阴性对照、二孔加入(jir)阳性对照各50ul/孔，其他各孔分别加入(jir)样本5
7、0ul(HBcAb测定时待测血清用生理盐水1:30稀释50ul血清+1.5ml生理盐水)。2.除空白孔外，各孔加入酶结合物50ul。3.在微型真当器上振荡30秒使孔内液体混合均匀（该步骤非常重要）。4.贴上板贴，置37下温育30分钟。,第十七页，共三十二页。,检验(jinyn)步骤,5.撕下板贴，洗板6次，最后在吸水纸上拍干。6.每孔加入底物液、显色剂各50ul，37避光反应10分钟。7.加终止液50ul/孔，轻轻振荡混匀后，立即测试结果。8.使用(shyng)酶标仪450nm单波长测量各孔的OD值。,第十八页，共三十二页。,第十九页，共三十二页。,第二十页，共三十二页。,第二十一页，共三十二
8、页。,结果(ji gu)判定,1.肉眼(ruyn)判定,第二十二页，共三十二页。,结果(ji gu)判定,2.酶标仪判定：用酶标仪单波长(bchng)450nm或双波长(bchng)450nm/630nm测定各孔OD值，根据OD值判定结果,第二十三页，共三十二页。,注意事项,浓缩洗涤液配制前充分摇匀。加样本(yngbn)时要加到孔底。加试剂前应将试剂瓶翻转数次，使液体混匀。如果滴加，滴加前应弃去1-2滴。,第二十四页，共三十二页。,注意事项,滴加时瓶身应保持垂直，以使滴量准确。勿将试剂滴在孔壁上。洗涤时各孔须加满，防止孔口(kn ku)内有游离酶残留。洗涤时注意孔与孔之间的交叉污染。脂血，溶血
9、可影响结果。,第二十五页，共三十二页。,注意事项,所有样本都应按传染源处理。样品显色深浅与样品中抗体的含量(hnling)没有一定正相关。任何一种测试都不能绝对保证样品中没有低浓度的抗体存在。不同品名、不同批号的试剂不可混用，以免产生错误结果。,第二十六页，共三十二页。,影响(yngxing)检测结果的因素,1.样本采集与处理的影响 1.1 标本严重溶血。1.2 标本凝固不全：血液还未开始凝固时即强行(qingxng)离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋原。2、试剂的影响 2.1 不同批号。2.2 不同厂家。,第二十七页，共三十二页。,影响检测(jin c)结果的因素,3.操作(cozu)技
10、术的影响 3.1 加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直接影响检测结果。3.2 温浴影响。3.3 手洗条件一致性较差，对结果影响较大，半自动与全自动洗板机使用不当也会影响结果。,第二十八页，共三十二页。,常见(chn jin)模式及临床意义,第二十九页，共三十二页。,常见(chn jin)模式及临床意义,第三十页，共三十二页。,谢谢(xi xie)！,第三十一页，共三十二页。,内容(nirng)总结,乙肝两对半测定 酶联免疫(miny)法。HBV感染呈世界性流行，但不同地区感染的流行程度差异很大。我国属高流行地区一般地区HBsAg阳性率为7.18%。急性感染恢复期和慢性持续感染。颜色反应的深浅与标本中相应抗体或抗原的量呈正比。血浆：使用抗凝血浆管（枸橼酸盐、EDTA盐、肝素之一为抗凝剂）采集样品。若标本有沉淀物形成，应离心除去，并确定未变质方可使用。3.洗液用蒸馏水作20倍稀释后备用。谢谢,第三十二页，共三十二页。,