1、第八章 血清型,【目的要求】1、掌握 HP、GC、TF的遗传特征2、熟悉(shx)HP、GC、TF的分型原理3、了解 血清型的亚型,第一页，共一百一十七页。,第一节 概 述,一、血清型的概念 人类某些(mu xi)血清蛋白具有遗传多态性，表型有个体差异，称为血清型（serum types）,第二页，共一百一十七页。,二、血清型的分类与命名根据分型原理不同，血清型可以分为两大类：1、同种异型遗传标记 是指同一种属不同个体免疫球蛋白抗 原性的差别(chbi)，可采用特异性抗血清分 型。如免疫球蛋白Gm、Km等,第三页，共一百一十七页。,这类血清型的命名多以抗原所在(suzi)的肽链名称加抗原编号组
2、成。如Glm抗原表示该抗原位于免疫球蛋白IgG1重链上,第四页，共一百一十七页。,2、血清蛋白的电泳多态性遗传标记 是指不同个体血清蛋白的电泳特性的差 异。是血清蛋白多肽链中部分肽链或个 别氨基酸不同，引起(ynq)电泳迁移率发生变 化构成的多态性,第五页，共一百一十七页。,这类血清型的命名通常是蛋白(dnbi)的缩写名称加表示等位基因的数字或字母，如Hp11,第六页，共一百一十七页。,三、分型原理1、免疫学的方法可以用来进行同种异型 遗传标记的分型，以特异性的抗体检 测同种异型抗原，确定(qudng)遗传标记的型 别。如红细胞被动凝集抑制试验、酶联 免疫分析等,第七页，共一百一十七页。,2、
3、在法医学鉴定中应用的血清型多数属于电泳性质上的多态性，需要(xyo)采用凝胶电泳技术分型 其分型原理为：不同表型的蛋白质一级结 构存在差异，分子量和等电点不同，在电 场中的迁移率不同，可依据蛋白谱带位置 进行分型,第八页，共一百一十七页。,等电聚焦技术则依靠不同蛋白分子之间等电点差异进行分型，分辨率比常规凝胶电泳高，能够揭示(jish)许多普通电泳难以检出的多态性。如维生素D结合蛋白普通电泳分为三种表现型，而等电聚焦技术分为六种,第九页，共一百一十七页。,等电聚焦电泳原理：所有的氨基酸均为两性(lingxng)物质，在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷。若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0
4、，且在电场中不移动时，称此pH值为它的pI值（等电点）。当溶液的pH值低于或高于pI，所有蛋白质分子所带净电荷为同号，彼此之间有相斥力，不会聚集。所以，將pH调到等电点的大小，则大部份的蛋白质將会沉淀，可以应用在电泳，达到分离蛋白质混合物的目的，这种方法称为等电聚焦电泳,第十页，共一百一十七页。,第十一页，共一百一十七页。,3、有些血清型在分型之前，样品需经神经(shnjng)氨酸酶或其他试剂处理，如转铁蛋白分型。因为糖蛋白糖侧链的电荷会影响蛋白电泳迁移率,第十二页，共一百一十七页。,4、电泳后的血清型谱带的显示可以用普通蛋白染色、免疫固定或免疫印迹法 蛋白染色操作简便，但谱带无特异性 免疫固
5、定后染色为特异性显色方法，主要 是利用(lyng)抗原抗体的特异性反应识别特异性 蛋白,第十三页，共一百一十七页。,典型的印迹实验包括三个步骤：蛋白质的电泳分离将电泳后凝胶上的蛋白质转移(zhuny)至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域免疫学检测。免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。,第十四页，共一百一十七页。,第十五页，共一百一十七页。,第一阶段为SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰酰凝胶中从阴极向
6、阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。此阶段分离效果肉眼(ruyn)不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。,第十六页，共一百一十七页。,第二阶段为电转移。将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流(dinli)（12A），通电45min转移即可完成。此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。,第十七页，共一百一十七页。,第三阶段为酶免疫定位。将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物(d w)，使区带染色。,第十八页，共一百一十七页。,几乎任何蛋白质都可用于免疫印迹。免疫印迹的
7、优势是能分析不能用其他的免疫化学技术(jsh)进行研究的蛋白质样品。例如，不能标记的蛋白质或不溶于温和抽提缓冲液的蛋白质等,第十九页，共一百一十七页。,6、DNA分型技术也可用于血清型分型。个体差异的实质(shzh)是人类基因组编码DNA的差异,第二十页，共一百一十七页。,四、法医学意义 自1939年发现血清中Hp的遗传多态性以来，血清型因分型可靠，个体(gt)识别率高等原因受到法医学的重视，多种血清型成为亲子鉴定选择的遗传标记,第二十一页，共一百一十七页。,第二节 结合(jih)珠蛋白型,结合珠蛋白（haptoglobin，Hp）：是人血清(xuqng)中能与游离血红蛋白（Hb）结合的一种a
8、糖蛋白。由三种表现型Hp1-1,Hp2-1，Hp2-2。受控于Hp座位上的一对等位基因Hp1和Hp2,呈共显性遗传。,第二十二页，共一百一十七页。,一、Hp的生化性质与生物学功能 由肝脏合成(hchng)，等电点为4.14.2，电泳 属于2球蛋白组分。含糖量为18.6 其主要功能是与游离血红蛋白结合成稳定的复合物，并很快被单核-巨噬细胞系统处理掉，阻止了血红蛋白从肾小球滤过，避免游离血红蛋白对肾小管的损害,第二十三页，共一百一十七页。,结合珠蛋白是一种血浆糖蛋白，分子量约为90.000。能与红细胞外血红蛋白(Hb)结合形成(xngchng)紧密的非共价复合物Hb-Hp。每天降解的Hb约有10%
9、释入血循环中，成为红细胞外游离的Hb，Hb与Hp结合成Hb-Hp复合物后分子量可达155,000，不能透过肾小球，从而防止游离血红蛋白从肾脏丢失，避免Hb所含铁的丢失。保证铁再用于合成代谢。,第二十四页，共一百一十七页。,溶血性贫血患者血浆结合珠蛋白浓度下降。由于溶血时大量(dling)的Hb释出，Hp与游离Hb结合成复合物而被肝细胞摄取、清除。此外，Hp也是一种急性期蛋白，患各种炎症时其血浆中含量升高。,第二十五页，共一百一十七页。,二、Hp的分子结构 是由两条多肽链和两条多肽链组成(z chn)的四聚体，各型之间只有链不同，而链都相同。链有1及2两种。而1又发现有1F及1S两种遗传变异体。
10、两种变异体的多肽链只有一个氨基酸的残基组成不同,第二十六页，共一百一十七页。,HP1-1 由两条hp1和两条hp链组成；HP2-2 由两条hp2链和两条hp链组成(z chn),第二十七页，共一百一十七页。,人的HP为一种2-球蛋白，其结构受遗传控制，其表型有三种(sn zhn)，即HP1-1、HP1-2、和HP2-2。每个人的表型可用简单的电泳法加以检验。HP的遗传为常染色体不完全显性，分别由HP1和HP2两个基因控制。1-1是HP1/HP1纯合子，1-2是HP1/HP2杂合子、2-2是HP2/HP2纯合子,第二十八页，共一百一十七页。,带HP1基因者结合血红蛋白(xuhng dnbi)较多
11、，HP2基因者结合血红蛋白较少，如1-1型平均结合血红蛋白为118g血红蛋白/L，1-2型为93g血红蛋白/L，2-2仅为75g血红蛋白/L。,第二十九页，共一百一十七页。,血清结合(jih)珠蛋白含量下降，甚至缺如，主要见于各种血管内溶血性疾病，如阵发性睡眠性血红蛋白尿症和吞豆病 中毒性肝炎、肝硬化等肝脏疾患、急慢性炎症、结核、肿瘤时结合珠蛋白含量会升高。另外，应用某些激素，如皮质激素和雄性激素后，也可使结合珠蛋白增高。,第三十页，共一百一十七页。,三、Hp基因 定位于人类第六号染色体的长臂上。包含编码hp链和hp的Hp基因以及Hp相关基因Hpr Hp*1基因含5各外显子。Hp*2基因是由两
12、条Hp*1DNA链组合而成，其结合(jih)位置分别位于第四和第二内含子，因此Hp*2基因含7个外显子,第三十一页，共一百一十七页。,Hp*1基因第四个外显子中第52、53位密码子的不同(b tn)可将Hp*1基因分为Hp*1F和Hp*1S（F即fast S即slow）。第52位为赖氨酸即快，第53位为谷氨酸即慢,第三十二页，共一百一十七页。,Hp*2基因(jyn)第四、第六外显子中的第52位，第53位与第111位，第112位密码子也具有Hp*1F和Hp*1S的差别 因此，Hp*2基因可分为Hp*2FF，Hp*2FS，Hp*2SS三个等位基因,第三十三页，共一百一十七页。,珠蛋白基因的多态性会
13、导致珠蛋白本身与血红蛋白的结合能力、抗氧化能力、人体内铁的代谢循环(xnhun)和免疫能力发生改变。既往的研究已经发现，珠蛋白基因的多态性对疟疾的发生和人体内红细胞溶解有着重要的意义,第三十四页，共一百一十七页。,珠蛋白2-2基因型是疟疾流行地区儿童贫血的危险因素，从而提示携带Hp2-2基因型的人体在疟疾引起红细胞溶血(rn xu)后，其珠蛋白结合游离血红蛋白的能力是下降的。不同珠蛋白基因型对Hb变化的影响更大,第三十五页，共一百一十七页。,四、Hp型的遗传多态性采用凝胶电泳技术可将不同个体的Hp分为三型，即HP1-1、HP2-1和HP2-2。每个人的表型可用简单的电泳法加以检验 HP的遗传为
14、常染色体不完全显性，分别由HP1和HP2两个基因(jyn)控制。1-1是HP1/HP1纯合子，1-2是HP1/HP2杂合子、2-2是HP2/HP2纯合子,第三十六页，共一百一十七页。,HP1-1型的电泳谱带呈现单一成分，泳动最快，靠近正极侧HP1-2和HP2-2型由多个成分组成，电泳迁移率较小，其谱带浓度(nngd)向负极呈逐渐递减趋势,第三十七页，共一百一十七页。,Hp*1基因的产物由Hp*1F和Hp*1S两个基因产物组成(z chn)，这样可以检出6种表现型，分别是Hp1S1S、Hp1S1F、Hp1F1F、Hp21F、Hp21S、Hp22,第三十八页，共一百一十七页。,五、Hp遗传变异大量
15、群体资料表明Hp存在许多遗传变异1、Hp0型 血液中Hp含量太低，用常规方法(fngf)测不出，称之为无结合珠蛋白血症。这些个体并无溶血性疾病,第三十九页，共一百一十七页。,此外，胎儿血液中不易测出Hp，部分新生儿可测出，4个月的婴儿Hp型别大部分可测出，个别情况直至15岁以后才能测出。胎儿及新生儿血中测不出Hp，不能称为Hp0型，这一点在涉及(shj)胎儿及婴幼儿的亲权鉴定时要注意,第四十页，共一百一十七页。,Hp0型的基因型为Hpdel/HpdelHp*del为沉默基因，其编码hp链的基因片断(pindun)缺失Hp*del基因以杂合状态存在时该个体呈现低结合珠蛋白血症,第四十一页，共一百
16、一十七页。,2、Hp1M型又称为修饰表现型21，是HP2-1与HP2-2 之间的过渡型Hp1M型的泳谱特点是快泳动带成分比例增多，而22区的线条非常(fichng)贫弱，有时易与HP2-1相混淆,第四十二页，共一百一十七页。,3、HpCa型此型快泳动带比例减少，而22区谱带明显增加，其产生可能是嵌合状态所致(su zh)，即一类细胞产生Hp22，另一类细胞产生Hp21,第四十三页，共一百一十七页。,4、HpJ1型此型的特点是11区的电泳(din yn)带分裂为两条，负极侧谱带增多5、HpK1型此型的特点是11区的电泳带分裂为两条，其余区域无蛋白带,第四十四页，共一百一十七页。,六、Hp型的群体遗传学调查结果亚洲(y zhu)人以HP2-2居多，其次为Hp21，而Hp11最少。高加索人以Hp21占优势，其次为HP2-2。黑种人群体中Hp11频率最高，其次为Hp21,第四十五页，共一百一十七页。,七、Hp型的分型原理及方法电泳前先使待测样品与血红蛋白形成HpHb复合物。电泳完后可以利用血红蛋白(dnbi)的过氧化物酶活性在过氧化氢存在时使联苯胺氧化成联苯胺蓝，染色,第四十六页，共一百一十七