1、第七章 农药及代谢产物(chnw)的测定,第一页，共二十五页。,第一节 有机磷农药(nngyo),有机磷农药绝大多数为杀虫剂，如常用(chn yn)的对硫磷、内吸磷、马拉硫磷、乐果、敌百虫及敌敌畏等，近几年来已先后合成杀菌剂、杀鼠剂等有机磷农药。有机磷农药多为磷酸酯类或硫代磷酸酯类，其结构式中R1、R2多为甲氧基（CH3O-）或乙氧基（C2H5O-）；Z为氧（O）或硫（S）原子：X为烷氧基、芳氧基或其他取代基团。,第二页，共二十五页。,一、理化(lhu)性质,有机磷农药大多呈油状或结晶状，工业品呈淡黄色至棕色，除敌百虫和敌敌畏之外，大多是有蒜臭味。一般不溶于水，易溶于有机溶剂如苯、丙酮、乙醚、
2、三氮甲烷及油类，对光、热、氧均较稳定，遇碱易分解破坏，敌百虫例外，敌百虫为白色(bis)结晶，能溶于水，遇碱可转变为毒性较大的敌敌畏。,第三页，共二十五页。,二、代谢和生物监测(jin c)指标,接触途径：农药的生产过程中，特别是出料、分装。施用农药以及装卸、运输、供销、保管过程中。吸收：有机磷农药中毒的途径可通过皮肤进入人体(rnt)。在喷洒过程的气雾可由呼吸道吸入；误服者由消化道吸收。分布：吸收后经血液和淋巴系统很快分布到全身，肝脏最高，还可以结合人蛋白质。,第四页，共二十五页。,代谢：氧化：脱硫作用、脱烷基、脱烷酰基、硫酯基的氧化。毒性增强。水解：降低毒性。结合：氧化产物，水解产物结合羧
3、酸(su sun)、醇、酚等而排泄，避免了抗胆碱酯酶活性。与蛋白质共价结合：迟发性神经毒性。,第五页，共二十五页。,正常生理情况：胆碱酯酶+乙酰胆碱（神经传递介质）乙酰胆碱酯酶胆碱酯酶+乙酸+胆碱有机磷农药中毒：抑制了胆碱酯酶的活性，造成组织中乙酰胆碱的积聚，其结果引起胆碱能受体活性紊乱，而使有胆碱能受体的器官功能发生(fshng)障碍。,第六页，共二十五页。,生物(shngw)监测指标,1、血液中胆碱酯酶活性作为接触生物(shngw)指标或效应性生物(shngw)标志物。轻度中毒：全血胆碱酯酶活性降至正常人的70%50%中度中毒：正常人的50%30%重度中毒：正常人的30%以下2、血液中有机
4、磷农药：接触性生物标志物,第七页，共二十五页。,三、样品(yngpn)采集,1.血液中有机磷农药测定：准确(zhnqu)采取肘静脉血2.5ml，立即置于盛有0.1mol/L盐酸溶液7.5ml的试管中，冰冻贮存。2.血液中胆碱酯酶活性测定：末梢血。,第八页，共二十五页。,四、血液(xuy)中有机磷农药的测定,1.原理：血液中有机磷农药在酸性条件下，环己烷萃取，气向色谱测定。2.仪器条件：色谱柱：2m3.2mm；Chromsorb W-HP，80100目；固定液：SE-30柱温：200；汽化室温度：240；检测(jin c)室温度：240；载气为高纯氮气，流量：50ml/min。燃气：氢气。,第九
5、页，共二十五页。,3.样品处理(chl)和测定,绘制标准曲线：0.4,2.0,4.0g/ml.用环己烷萃取：取8ml+2ml环己烷振荡，离心。PT-C18色谱(s p)预处理柱净化：上清液。定容：氮气流挥发至0.1ml。进样：15ml。,第十页，共二十五页。,五、全血胆碱酯酶活性的测定(cdng),（一）三氯化铁分光(fn un)光度法1.原理,红棕色羟肟酸铁配合(pih)物 520nm,第十一页，共二十五页。,（1）.绘制标准曲线用ph=7.20的磷酸缓冲液配置(pizh)乙酰胆碱标准系列，04.00mol。,各管+碱性羟胺溶液4ml，振摇3min;加1+2盐酸(yn sun)2ml，振摇1
6、min；加10%三氯化铁溶液2ml，摇匀，过滤。520nm处，测定吸光度，绘制标准曲线。,2、样品处理(chl)和测定,第十二页，共二十五页。,（2）.样品处理(chl)和测定取A和B两管,各加入水0.96ml及耳垂血40u1,摇匀,置于37水浴中,预热510min.,向样品管A中,加乙酰胆碱标准液1ml,准确(zhnqu)计时,于370.5水浴30min后，立即加碱性羟胺4ml,振摇3min终止反应。,2、样品处理(chl)和测定,第十三页，共二十五页。,向对照管(zhogun)B中，先加碱性羟胺4ml，振摇3min，再加乙酰胆碱标准液1ml。,向A和B两管中,各加1+2盐酸2m1,振摇1m
7、in,然后各管加10三氯化铁溶液2ml,摇匀,过滤。于520nm处测定(cdng)吸光度。,第十四页，共二十五页。,（3）.结果(ji gu)计算,被水解(shuji)乙酰胆碱的吸光度B管吸光度A管吸光度,被水解(shuji)乙酰胆碱的量（mol）,40u1血 胆碱酯酶活性绝对值（C）,全血胆碱酯酶活性值(mol/ml)C/0.04,正常人全血胆碱酯酶活性值,胆碱酯酶活性百分数：,接触者全血胆碱酯酶活性值,100%,第十五页，共二十五页。,3.注意事项,采血时不应过度挤压耳垂。如果过度挤压耳垂，采得的血液中血清或组织液占比例过多，结果偏低。氯化乙酰胆碱在空气中极易潮解，称量速度要快。水浴温度和
8、时间(shjin)对酶作用有明显影响，温度控制在370.5，时间控制在0.5min内。,第十六页，共二十五页。,加三氯化铁显色后，棕红色配合物易褪色，必须在510min比色。计算胆碱酯酶活性百分数需要健康人群(rnqn)全血胆碱酯酶活性值作标准。可用本地区的未接触健康人作测定，求得正常人胆碱酯酶活性值，一般正常人数不少于30名。,第十七页，共二十五页。,（二）DTNB分光(fn un)光度法,1.原理(yunl)：,黄色(hungs)v 412nm,第十八页，共二十五页。,2.样品处理(chl)和测定,（1）绘制标准曲线1.0mol/mol的巯基标准0、0.1、0.2、0.3、0.4ml+水至
9、0.5ml，+磷酸(ln sun)缓冲液1.5ml，+DTNB溶液0.5ml412nm处测定吸光度。1ml 1.0mmol/mol的巯基标准1.0mol谷胱甘肽1.0mol硫代胆碱胆碱酯酶活力：0、20、40、60、80mol/ml。,第十九页，共二十五页。,（2）样品的测定取血样10l放入盛有3ml磷酸缓冲液的小试管中;取出1.50ml作为测定样，原管为对照样；对照管中加入一滴抑制剂（毒扁豆碱溶液）；向两管中各加DTNB 0.50ml，37水浴预温5min;分别向两管加入乙酰胆碱0.50ml，记时；37水浴准确(zhnqu)反应6min后，向测定管加1滴抑制剂终止反应；离心除去血细胞，取上清
10、液于比色管中，412nm测定吸光度。测定管吸光度为A，对照管吸光度为A.,第二十页，共二十五页。,(3)结果计算根据测得的A-A，得到吸光度差值A，即为酶水解(shuji)产生的硫代胆碱的显色深度，查标准曲线得到胆碱酯酶活性单位。,第二十一页，共二十五页。,3.注意事项,（1）红细胞中，乙酰胆碱酶全部存在于细胞膜表面，测定不需要红细胞溶解。如有溶血的血红蛋白在414415nm处有吸收(xshu)峰。为防止溶血，本法所用的溶液均为等渗溶液。（2）对照管的吸光度A如果超过0.070.08，说明有明显溶血，测定结果偏低。或说明乙酰硫代胆碱已分解变质。,第二十二页，共二十五页。,（3）抑制剂应妥善处理
11、，严防污染器材和试剂。实验结束后，所有器材需用肥皂水洗刷，用重铬酸钾(zhn sun ji)硫酸洗液浸泡，清水洗净，用蒸馏水淋洗，以除去残留的抑制剂。,第二十三页，共二十五页。,Thank You!,第二十四页，共二十五页。,内容(nirng)总结,第七章 农药及代谢产物的测定。胆碱酯酶+乙酸+胆碱。1、血液中胆碱酯酶活性作为接触生物(shngw)指标或效应性生物(shngw)标志物。绘制标准曲线：0.4,2.0,4.0g/ml.。用环己烷萃取：取8ml+2ml环己烷振荡，离心。（2）.样品处理和测定。取A和B两管,各加入水0.96ml及耳垂血40u1,摇匀,置于37水浴中,预热510min.。被水解乙酰胆碱的吸光度B管吸光度A管吸光度。Thank You,第二十五页，共二十五页。,