1、第三章核 酸 技 术,第一页，共三十八页。,核酸的分离和纯化核酸电泳染色体DNA电泳 DNA限制酶切反应和限制酶谱绘制(huzh)DNA的连接PCR技术分子杂交技术 核酸序列的测定,第二页，共三十八页。,第一节核酸(h sun)的分离和纯化,第三页，共三十八页。,一、一般程序 1、供体的核酸分离(fnl)供体细胞培养 收集(菌体)细胞 细胞破碎 分离总DNA 分离细胞器 分离总RNA 分离细胞器DNA RNA poly(A)RNA 特异性RNA 染色体DNA(组建基因组文库),第四页，共三十八页。,2、载体DNA分离 载体DNA 感染或转染细胞（病毒型）转化细菌细胞（质粒型）分离病毒颗粒(kl
2、)培养转化细胞、收集菌体 病毒载体DNA分离与纯化 破碎细胞 质粒DNA分离与纯化 3、DNA片段的分离 DNA 限制酶切 凝胶电泳分离 特定DNA片段的回收,第五页，共三十八页。,4、质量评估 1）凝胶电泳 2）光密度值测定 3）限制酶切分析二、细胞裂解 1.酶法：利用某些细胞壁裂解酶使细胞变为原生质体，然后加去垢(q u)剂使原生质体裂解。1)细菌：溶菌酶 2)酵母：蜗牛酶、Novozyme234、glusulase、zymolase 等 3)丝状真菌：Novozyme234、溶壁酶、纤维素酶 4)植物细胞：纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶 酶法裂解时要注意细胞的生长条件和生长时间，反应时尽可
3、能满足酶的最佳反应条件。,第六页，共三十八页。,2.机械法 1)压力剪切法：French压力机，酵母细胞，细菌（芽孢和G+球菌除外(chwi)）2)射击破碎法：Braun破碎机，搅切器（blender），混合器（mixer），0.1-0.45mm玻璃球 3)固体研磨法：将待破碎细胞与玻璃球（0.10.45mm）同时致冷，在未融熔前用研杵磨成粉末 4)反复冻融法 三、DNA的分离与纯化 1、供体DNA的分离与纯化 要求：尽可能地保持其高分子量，无其它污染物。1)基因组大小：,第七页，共三十八页。,染色体细菌 33004200kb酵母(jiom)15,000 kb果蝇 1.28x105 kb人 3
4、x106 kb植物 2x1051x108 kb 天花病毒 288 kb痘病毒 196 kb质体 几100以上kb,线粒体 藻类 线状 15kb酵母 环状 1978 kb植物(zhw)环状 100150 kb动物(扁虫到人)环状 1518 kb锥虫 网状 6000 kb(幼体)短膜虫 网状 30,000 kb(幼体)(Kinetoplast）,叶绿体双子叶植物 121（菠菜(bci)）154kb（豌豆）单子叶植物 151（玉米）182kb（浮萍）藻类 132（裸藻）191kb（衣藻）,第八页，共三十八页。,第九页，共三十八页。,2)CsCl密度梯度离心上清液 加入固体CsCl与EtBr溶液 室温
5、下超速离心(45,000rpm）16小时 穿孔取出DNA（320nm）异丙醇抽提溴乙锭 缓冲液透析除去残余CsCl 两倍体积冷乙醇沉淀DNA 离心、洗涤、干燥*两种方法比较：CsCl法操作步骤少，分离DNA分子量大，耗财多，且需超速离心机。苯酚法耗时少，不需昂贵仪器，但操作步骤多，易使DNA分子断裂。若 小心操作，所获DNA亦符合要求。*上述两种分离方法都包含了下述四个分离步骤.可溶与不可溶物分离：高速离心除去细胞碎片，保留上清液。.使蛋白质分离：苯酚抽提或超速离心.使RNA分离：RNase处理(chl)或超速离心.使DNA与其它可溶物分离,第十页，共三十八页。,2.载体DNA的分离与纯化 1
6、)质粒载体DNA的分离 关键：如何(rh)使质粒DNA与宿主染色体DNA分开 原理：质粒DNA比染色体DNA 小得多，在DNA抽提过程中，染色体DNA断裂成小片段(线状)，质粒DNA仍保持超螺旋构型,第十一页，共三十八页。,方法：.超速离心：利用两种DNA分子的大小和空间构型.变性法：在变性条件下使染色体DNA变为单链，而质粒DNA仍保持环状结构，当变性条件发生(fshng)迅速变化时，前者仍不能复性，而后者又可回复到天然构型。变性条件可采用加热煮沸法或碱变性法上述方法亦可用于ss环状病毒DNA RF型的分离,质粒DNA的氯霉素扩增使用并不广泛（菌株和载体）2)噬菌体载体DNA的分离 纯净病毒
7、颗粒 病毒载体DNA M13mp载体可采用质粒DNA的分离方法,第十二页，共三十八页。,二、RNA的分离与纯化 1.制备RNA的关键防止内外源RNase的作用 1)RNase的特点：抗酸抗碱,具很广pH作用范围;抗高温严寒(065均具活性）；抗变性剂 2)解决办法：外源RNase高温，焦磷酸二乙酯(DEPC)处理所有溶液（TrisHCl除外）和器皿，操作者带手套 内源RNase高温抽提，强蛋白质变性剂，RNase抑制剂，蛋白酶K等 2.总RNA的制备 根据所用蛋白质变性剂种类不一样分为以下三种(sn zhn)制备方法：1）热苯酚抽提法 2）胍盐法：异硫氰酸胍和硫氰酸胍 3）LiCl/尿素法,第
8、十三页，共三十八页。,其中以胍盐法最好，对于从那些RNase含量很高的组织（胰脏）中提取(tq)RNA特别有效，可使RNase迅速变性，制备的RNA有较高翻译活性。在RNA制备中，细胞破碎与蛋白质变性是同步进行的。,3.多聚核糖体RNA的制备 1)多聚核糖体的分离(fnl)超速离心法（30-40万g，离心2-3 h）镁盐沉淀法（0.1 M Mg+）分级分离法分离特异性多聚核糖体,第十四页，共三十八页。,i.结合与游离核糖体的分离，这种方法可避免溶酶体破裂。ii.核糖体大小分级分离，利用连续密度梯度分离特大和特小的 多聚核糖体 iii.核糖体免疫沉淀法*直接免疫沉淀法 新生肽链+抗体(kngt)
9、蔗糖密度梯度离心*间接免疫沉淀法 新生肽链+抗体+抗-抗体（二抗）不可 溶复合物 离心分离,第十五页，共三十八页。,*免疫亲和层析法 新生肽链-抗体复合物 不溶性交联抗原基 质亲和层析柱吸附 洗脱 免疫沉淀法优点：可分离到含量仅为1%的mRNA，但必须使用高纯度的抗体，不能发生(fshng)交叉反应和污染核酸酶 2)多聚核糖体RNA的分离纯化多聚核糖体+SDS 蔗糖密度梯度离心或蛋白酶K-苯酚抽提 4.RNA的分级分离 1)分子量大小分级分离 i.蔗糖密度梯度离心 ii.凝胶电泳 2)核酸序列分级分离 i.分子杂交法：适用于同源性很高的RNA的分离DNA分子变性 结合到NCF RNADNA杂交
10、 洗涤 洗膜 乙醇沉淀,第十六页，共三十八页。,ii.亲和层析法：低聚dT纤维素:用于poly(A)较长的mRNA；多聚U琼脂糖:用于poly(A)较短的mRNA（20A）RNA进样吸附 洗涤 洗脱 收集(shuj)260nm处吸收峰样品 乙醇沉淀 iii.无poly(A)mRNA的分离 纯化多聚核糖体 核糖体亚基+mRNP 离心 mRNP 蛋白酶K mRNA 低聚（dT）纤维素层析 洗出液 乙醇沉淀（无多聚A mRNA）5.RNA的质量评估方法 1)光密度值测定法 A260/A280=2.0 2)凝胶电泳 3)体外蛋白质翻译,第十七页，共三十八页。,第十八页，共三十八页。,第二节核 酸 电
11、泳,第十九页，共三十八页。,1.种类 1)按凝胶材料分:聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳(普通琼脂糖和低熔点琼脂糖)2)按电泳装置分:水平式/琼脂糖凝胶;竖式/聚丙烯酰胺凝胶 3)两种方法比较：分离效果和分离范围;操作难易 2.用途 琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规(chnggu)分析；聚丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。3.凝胶电泳的一般程序 制胶 点样 电泳 染色 观察二、DNA电泳 1.DNA分子种类 1)线状DNA单链与双链，ss-DNA电泳时要注意局部区域形成ds-DNA，造成迁移距离不确定 2)环状DNA单链（如M13mp）和双链（质粒DNA）3)线状ds-DNA电泳使用频率最高的
12、一种电泳,第二十页，共三十八页。,这类DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个(j)因素的影响：i.分子量 的大小:迁移距离与分子量的常用对数成反比 ii.凝胶浓度:浓度越高，移动距离越短，适合分离低分子量DNA浓度越低，移动距离越长，适合分离高分子量DNA,iii.电压:低电压时，迁移率与电压成正比；电压增高时，不同(b tn)大小DNA片段迁移率增大是不同(b tn)的。iv.碱基组成与温度:不受影响,温度高可导致DNA带变形或解链。,第二十一页，共三十八页。,4)环状ds-DNA电泳(din yn):常用于质粒DNA的初步鉴定5)线状ss-DNA电泳 链分离凝胶：化学定序时，用于单链分
13、离。DNA双链互补，但组成不一样，仍可分离（机理不详），电泳时形成三条带：变性双链，两条单链。,核酸定序凝胶(染料指示剂)：为避免局部区域产生(chnshng)二级结构，可采用各种变性措施，如煮沸样品，提高电泳温度，凝胶中加入变性剂（尿素、甲醛、甲胺等）,第二十二页，共三十八页。,三.RNA凝胶电泳 方法：不同的RNA电泳方法是依据使RNA分子变性所采取的方法。这些方法不仅要使RNA分子在点样时是一级结构，而且在整个电泳过程(guchng)中也保持一级结构。1.乙二醛/二甲基亚砜法 原理：乙二醛可以与核酸、核苷酸及碱基发生反应，特别是鸟苷形成一个稳定的附加环，从而阻止GC碱基的互补作用发生 步
14、骤：RNA+10mM羟甲基醛和50%DMSO混合 50、1 h变性 点样 电泳 染色 观察 2.羟甲基汞法 原理：羟甲基汞可与RNA分子的嘌呤或嘧啶碱基发生反应，反应部位是在可形成氢键的亚氨基处。步骤：RNA+10mM羟甲基醛 点样在含4mM羟甲基醛的琼脂糖凝胶上 电泳 染色观察,第二十三页，共三十八页。,3.甲醛法 步骤：RNA+2.2M甲醛+50%甲胺 点样在含2.2M甲醛琼脂糖凝胶上 MOPS缓冲液电泳 染色观察 其它变性剂，如尿素、甲胺等也可用于RNA电泳.4.三种方法的比较 第一种方法安全，但由于反应是不可逆的，由此回收的RNA样品用于体外翻译效果不好(b ho)。第二、三种方法的反
15、应可逆，回收RNA样品可用于体外翻译反应，但操作必须小心，因两种变性剂有毒。五、蛋白质电泳 方法：变性与非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，前者常称之为SDS-PAGE。差别：有无变性剂 用途：非变性凝胶可用于蛋白质的分离纯化过程中，可直接用于酶促反应（颜色变化）SDS-PAGE可用于蛋白质分子量、亚基组成的测定。mRNA翻译产物，基因表达产物测定等。,第二十四页，共三十八页。,五、核酸片段的分离与回收 1.方法 用于DNA、RNA以及蛋白质的回收 1)电洗脱法:利用(lyng)电泳方法将凝胶中的特定核酸分子到其它介质中；2)滤纸法 核酸凝胶染色 长波紫外光确定位置 在分离带前方切一口子并插入滤纸条(其
16、背面覆盖透析袋膜)电泳至DNA带全部进入滤纸条 洗脱DNA 纯化、沉淀 3)透析袋法切下含DNA带琼脂块 放入透析袋，封口 放入电泳槽 电泳23小时至全部DNA离开凝胶块 反向电泳1分钟 取出DNA液 纯化、沉淀 4)冻融法 5)酶解法,第二十五页，共三十八页。,回收(hushu)DNA方法,第二十六页，共三十八页。,2.影响回收率的因素 1）DNA分子大小回收率与分子量大小呈负相关；2）乙醇沉淀其中温度、时间和DNA浓度（回收时体积）均与回收率有关(yugun)；3）离心时间时间越长，效果越好，对低浓度DNA尤其明显。3.回收DNA片段质量 凝胶材料的质量，如琼脂糖中的硫酸盐 沉淀剂若改用精胺，它可有效地去除PEG、核苷酸、盐、聚丙烯酰胺及蛋白质等。,第二十七页，共三十八页。,第三节 染色体DNA电泳(din yn),第二十八页，共三十八页。,一、DNA分子在凝胶电泳中的移动 1、常规电泳 在自由电场中，DNA的移动速度与分子量大小无关；将DNA分子置于凝胶中进行电泳，DNA移动距离与分子量有关。分子量小的移动快；反之则慢。大于20kb的DNA大分子，其移动距离与分子量无关。因为这些