1、,作者:褚云卓,单位:中国医科大学附属第一医院,第九章,临床常见病原体检测,第一节 标本的采集运送、实验室评价和检查方法,第二节 病原体耐药性检测,第三节 临床感染常见病原体检测,第四节 病毒性肝炎检测,第五节 性传播疾病病原体检测,第六节 医院感染常见病原体检查,重点难点,临床病原体检查标本的采集运送及实验室质量评估原则；各种病原体检查结果的临床意义。,医院感染的概念及监控方法；病原体耐药性概念及临床常见耐药株。,病原体常规检查项目和特殊检查方法。,标本的采集运送、实验室评价和检查方法,一,1.采血时机 一般在发热初期、寒颤时或发热高峰到来前0.51小时采集血培养标本，对 已应用抗菌药物治疗
2、者，应在下次用药前采集。,（一）血液,2.皮肤消毒 三步消毒法：70%乙醇30秒；1%2%碘酊1分钟；第三步70%乙醇擦拭皮肤30秒。,诊断学（第9版）,一、标本采集和运送,3.采血部位及采血量 肘静脉，成人每次1020 ml，需氧瓶和厌氧瓶各一瓶；婴儿和儿童15ml，两个儿童瓶。,（二）尿液,清洁中段尿约1020 ml于灭菌容器内。,（三）粪便,取含脓、血或黏液的粪便置于清洁容器。,合格的痰标本：低倍镜视野中鳞状上皮细胞10个、白细胞25个,（四）呼吸道标本,诊断学（第9版）,（五）脑脊液与其他无菌体液,1.脑脊液 应立即保温送检或床边接种2.胸水、腹水和心包液 宜采集较大量标本送检，可接种
3、于血培养瓶3.腹膜透析液 含菌量非常低，至少需采集50ml,（六）眼、耳部标本,1.眼部标本 运送拭子或角膜刮屑2.中耳标本 运送拭子采样,采集尿道口分泌物、外阴糜烂面病灶边缘分泌物、阴道宫颈口分泌物和前列腺液等,（七）生殖道标本,诊断学（第9版）,（八）创伤、组织和脓肿标本,1.开放性脓肿 用无菌拭子采集病灶边缘及深部分泌物，或采集组织标本2.封闭性脓肿 则以无菌干燥注射器穿刺抽取脓肿边缘及底部的脓汁,（九）血清,用于检测病人产生特异性抗体的效价以辅助诊断感染性疾病,标本送至病原体实验室后，工作人员应对标本信息、采集方式、采集部位、运送方式等各方面进行质量评估，决定是否接收标本进行下一步检测
4、或建议重新采集以确保检测结果的准确性。质量不合格标本得出的结果会给医生提供错误的信息，导致误诊和治疗不当。因此，实验室必须遵循严格的标本接收和拒收准则。取材特别困难、储存运送条件简陋等情况下，即使标本质量不符合要求也必须要作检测。,诊断学（第9版）,二、标本的实验室质量评估标准,诊断学（第9版）,三、检 查 方 法,（一）直接显微镜检测,1.涂片染色显微镜检查 观察细菌的形态、染色性或观察宿主细胞内包涵体的特征2.涂片不染色显微镜检查 观察病原菌的生长、运动方式、螺旋体的形态和运动3.荧光显微镜检查和免疫电镜检查 荧光显微镜检查结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌和白喉棒状杆菌；电镜检查用于轮状病毒等病
5、毒颗粒,（二）病原体特异性抗原检测,用已知抗体检测病人血清及其他体液中的待测抗原。主要方法：免疫荧光技术、酶联免疫技术、化学发光技术、胶乳凝集试验、对流免疫电泳等,诊断学（第9版）,（三）病原体核酸检测,1.常用方法 聚合酶链反应（PCR）、核酸探针杂交技术和实时荧光定量PCR2.适用病原体 不能分离培养或难分离培养的微生物，如病毒,（四）病原体的分离培养和鉴定,1细菌和真菌感染性疾病病原体的分离培养 根据菌落性状、细菌形态和染色性、生化反应、血清学实验等对分离菌作出鉴定并做药敏试验2不能人工培养的病原体感染性疾病 标本接种易感动物、鸡胚或合适的细胞,诊断学（第9版）,（五）血清学试验,1.常
6、用方法 凝集试验、沉淀试验、补体结合试验、间接免疫荧光技术、放射免疫测定、酶联免疫吸附试验等2.用已知病原体的抗原检测病人血清中相应抗体,（六）细菌毒素检测,1.内毒素 用于革兰氏阴性菌感染的快速诊断，可对病人的血液、尿液及脑脊液进行直接检查。2.外毒素 近年来发展的生物传感器可检测出fg水平的葡萄球菌肠毒素、肉毒毒素和霍乱肠毒素。,病原体耐药性检测,二,1.革兰阴性菌 主要是铜绿假单胞菌、大肠埃希菌、克雷伯菌和肠杆菌属细菌等,（一）耐药病原体,2.革兰阳性菌 金黄色葡萄球菌和凝固酶阴性葡萄球菌和肠球菌为主,诊断学（第9版）,一、耐药性及其发生机制,（二）耐药机制,2产生灭活抗生素的水解酶和钝
7、化酶等,1细菌水平和垂直传播耐药基因的整合子系统,3细菌抗生素作用靶位的改变,4细菌膜的改变和外排泵出系统,5细菌生物膜的形成,K-B纸片琼脂扩散法、稀释法、浓度梯度纸条扩散法（E试验）、耐药筛选试验,（一）药物敏感试验,诊断学（第9版）,二、检查项目、结果和临床应用,（二）耐药菌监测试验,1耐甲氧西林葡萄球菌（MRS）2高浓度氨基苷类耐药肠球菌 3耐青霉素肺炎链球菌（PRSP）4-内酰胺酶 5超广谱-内酰胺酶（ESBL）,（三）病原体耐药基因的检测,临床感染常见病原体检测,三,感染性疾病指各种病原体（病原微生物、寄生虫）感染人体后机体组织细胞受到不同程度损害并出现一系列临床症状和体征。包括传
8、染性感染疾病（传染病）（communicable infectious diseases）和非传染性感染疾病（non-communicable infectious diseases）。,诊断学（第9版）,感染性疾病（infectious diseases）,1.疾病谱发生变迁 新的传染病陆续被发现：埃博拉病毒、SARS冠状病毒2.多重耐药菌不断出现 MRSA、产ESBL菌株、碳青霉烯耐药肠杆菌、多重耐药的鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌等3.病人免疫防御功能降低 器官移植、抗肿瘤化疗和放疗,（一）流行病学,诊断学（第9版）,一、流行病学和临床类型,（二）临床类型,可导致人类感染性疾病的病原体约50
9、0种以上，包括病毒、细菌、真菌、支原体、衣原体、立克次体、螺旋体和寄生虫等。,1.检测细菌或其抗原 主要包括直接涂片显微镜检查、培养、抗原检测与分析2.检测抗体3.检测细菌遗传物质 主要包括基因探针技术和PCR技术,（一）细菌感染,诊断学（第9版）,二、检查项目和临床应用,（二）病毒感染,1.病毒分离培养与鉴定2.病毒核酸3.抗原检测,1.直接显微镜检查2.分离培养及鉴定3.免疫学试验4.动物试验,（三）真菌感染,诊断学（第9版）,（四）寄生虫病,1.病原学诊断2.免疫学诊断3.其他实验室常规检查,1.支原体检测 支原体（mycoplasma）是一群介于细菌与病毒之间，可通过滤菌器、无细胞壁，
10、能在无生命培养基中生长繁殖的最小原核微生物。2.螺旋体检测 螺旋体（spirochetes）是一群细长、柔软、运动活泼、呈螺旋状的微生物。3.立克次体检测 立克次体（rickettsia）是一类严格细胞内寄生的原核细胞型微生物，在形态结构、化学组成及代谢方式等方面均与细菌类似。4.衣原体检测 衣原体（chlamydiae）为专性细胞内寄生物，在宿住主细胞内繁殖有特殊生活周期，可观察到两种不同的颗粒结构，即原体和网状体。,（五）其他病原体感染,诊断学（第9版）,1.临床标本分离和培养的阳性结果最具有诊断价值2.经病原体鉴定，可明确诊断病原体的种类，并可作药物敏感试验3.抗原成分检测有助于早期诊断
11、感染性疾病4.核酸检测已成为现代感染性疾病早期诊断的可靠方法之一5.血清学试验是目前应用最广泛的感染性疾病检测方法,（六）实验结果分析和临床应用,诊断学（第9版）,病毒性肝炎检测,第四节,HAVAg一般于发病前115天可从粪中排出，2周后消失，临床上不易捕捉到。粪便中HAV或HAV抗原颗粒检测可作为甲肝急性感染的证据。,（一）抗原检测,诊断学（第9版）,一、甲型肝炎病毒检测,（二）抗体检测,1.抗HAV-IgM 在发病后2周抗HAV-IgM的阳性率为100，12个月时可为阴性。2.抗HAV-IgA 早期和急性期，由粪便中测得抗HAV-IgA呈阳性反应，是早期诊断甲肝的指标之一。3.抗HAV-I
12、gG 阳性出现于恢复期且持久存在，是获得免疫力的标志，提示既往感染，可作为流行病学调查的指标。,（三）HAV-RNA测定,HAV-RNA阳性对诊断特别对早期诊断具有特异性。,（一）乙肝六项检测,诊断学（第9版）,二、乙型肝炎病毒检测,1.HBsAg 阳性见于急性乙肝的潜伏期，发病时达高峰；如果发病后3个月不转阴，则易发展成慢性乙型肝炎或肝硬化。携带者 HBsAg也呈阳性。2.抗-HBs 是保护性抗体，可阻止HBV穿过细胞膜进入新的肝细胞。抗-HBs一般在发病后36月才出现，可持续多年。3.HBeAg 阳性表明乙型肝炎处于活动期，并有较强的传染性。4.抗-HBe 阳性可见于慢性乙型肝炎、肝硬化、
13、肝癌。5.抗-HBc 抗-HBc总抗体主要反映的是抗-HBc IgG。抗-HBc比HBsAg更敏感，可作为HBsAg阴性的HBV感染的敏感指标。在HBsAg携带者中多为阳性。6.HBcAg 阳性，提示病人血清中有感染性的HBV存在，含量较多表示复制活跃，传染性强，预后较差。,(二)乙型肝炎病毒表面抗原蛋白前S1和前S1抗体测定,诊断学（第9版）,前S1抗原可识别肝细胞表面特异性的病毒受体，是非常重要的传染性指标。同时血清前S1抗原的存在与病毒复制的关系密切。作为病毒复制指标较HBeAg敏感，可以反映HBeAg阴性乙肝病人体内的病毒活动状况，避免由于HBeAg阴性造成的误诊和漏检，对“二对半”检
14、测起重要的补充作用。前S1抗原阴转越早、前S1抗体阳转越早，病人病程越短、预后越好。,（三）乙型肝炎病毒表面抗原蛋白前S2和前S2抗体测定,Pre-S2阳性提示HBV复制异常活跃，有传染性。抗 Pre-S2阳性见于乙肝急性期及恢复早期；提示HBV已被清除，预后较好。,诊断学（第9版）,HBV-DNA阳性是诊断乙型肝炎的佐证，表明HBV复制及有传染性。也用于监测应用 HBsAg疫苗后垂直传播的阻断效果，若 HBV-DNA阳性表明疫苗阻断效果不佳。,（五）乙型肝炎病毒YMDD变异测定,YMDD是HBV反转录酶发挥催化活性所必需的关键结构。目前临床上广泛使用的胞苷类似物拉咪呋啶(lamivudine
15、)等抗HBV药物，作用靶位主要是HBV反转录酶，通过与底物dNTP竞争结合以抑制HBV的反转录和复制。当病毒YMDD中M突变为异亮氨酸（I）或缬氨酸(V)，就可能引起HBV该类药物的药效丧失，从而产生耐药性。YMDD测定结果为临床抗HBV治疗用药提供了实验室诊断依据。,（四）乙型肝炎病毒DNA测定,（一）丙型肝炎病毒RNA测定,诊断学（第9版）,三、丙型肝炎病毒检测,阳性提示HCV复制活跃，传染性强；HCV-RNA转阴提示HCV复制受抑，预后较好。连续观察HCV-RNA，结合抗-HCV的动态变化，可作为丙肝的预后判断和干扰素等药物疗效的评价指标。检测HCV-RNA，对研究丙型肝炎发病机理和传播
16、途径有重要价值。,（二）丙型肝炎病毒抗体测定,1.抗-HCV IgM抗体 主要用于早期诊断，抗-HCV IgM抗体一般在发病的24天出现，持续阳性常可作为转为慢性肝炎的指标，或是提示病毒持续存在并有复制。2.抗-HCV IgG抗体 阳性表明已有 HCV感染但不能作为感染的早期指标。经常接受血制品（血浆、全血）治疗的病人可以合并HCV的感染，易使病变转为慢性、肝硬化或肝癌。,（一）丁型肝炎病毒抗原测定,诊断学（第9版）,四、丁型肝炎病毒检测,丁型肝炎病毒抗原（HDVAg）出现较早，但仅持续 l2周。HDVAg与HBsAg同时阳性，表示丁型和乙型肝炎病毒同时感染，病人可迅速发展为慢性或急性重症肝炎。,（二）丁型肝炎病毒抗体测定,1.抗-HDV IgG 阳性只能在HBsAg阳性的血清中测得，是诊断丁型肝炎的可靠指标，病愈后仍可存在多年。2.抗-HDV IgM 出现较早，一般持续220周，可用于丁型肝炎早期诊断。,（三）丁型肝炎病毒RNA测定,阳性可明确诊断为丁型肝炎。HDV与HBV重叠感染的病人易迅速发展成肝硬化或肝癌。,诊断学（第9版）,五、戊型肝炎病毒检测,1.抗-HEV IgM 95%