1、 收稿日期:2022-05-24 基金项目:安徽省高校自然科学基金(KJ2019A0164)资助。作者简介:吴红军，硕士研究生。E-mail：*通信作者:朱若林，博士，讲师。E-mail： 安徽农业大学学报,2023,50(3):457-462 Journal of Anhui Agricultural University DOI 10.13610/ki.1672-352x.20230625.020 网络出版时间：2023-06-27 10:55:56 URL https:/ 鲤疱疹病毒 2 型 ORF144 原核表达和多克隆抗体制备 吴红军，潘李佳，李 节，何艳格，杜宏瑶，龚保荣，吴宜靖，
2、鲍传和，朱若林*(安徽农业大学动物科技学院，合肥 230036)摘 要：鲤疱疹病毒 2 型(Cyprinid herpesvirus 2，CyHV-2)引起的鲫造血器官坏死病是近年来对鲫(Carassius carassius)养殖业危害最大的疾病之一。通过 PCR 扩增得到 ORF144 基因全长，将其与 pET-32a 原核表达载体连接构建重组载体 pET-ORF144，转化到大肠杆菌中，经 IPTG 诱导表达得到大小约 46 kDa 的重组蛋白，该蛋白主要以不可溶的包涵体形式存在。将重组融合蛋白纯化后免疫 BALB/c 小鼠获得多克隆抗体，间接 ELISA 检测显示抗体效价大于 151
3、200。经 Western Blot 验证该抗体可特异性识别感染 CyHV-2 的细胞中的蛋白质和纯化的融合蛋白。间接免疫荧光结果显示该蛋白定位于细胞质，呈点状分布。结果表明构建的 ORF144 多克隆抗体可为病毒的基因功能和致病机制研究提供基础。关键词：鲤疱疹病毒 2 型；ORF144；原核表达；多克隆抗体 中图分类号：S941 文献标识码：A 文章编号：1672-352X(2023)03-0457-06 The prokaryotic expression and polyclonal antibody preparation of Cyprinid herpesvirus 2 ORF14
4、4 WU Hongjun,PAN Lijia,LI Jie,HE Yange,DU Hongyao,GONG Baorong,WU Yijing,BAO Chuanhe,ZHU Ruolin(School of Animal Science and Technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036)Abstract:Haematopoietic necrosis in Carassius carassius is one of the most damaging diseases in recent years caused by Cy
5、prinid herpesvirus 2(CyHV-2).CyHV-2 belongs to the family Alloherpesviridae and the genus Cy-prinivirus.The genus also includes Cyprinid herpesvirus 1(CyHV-1),Cyprinid herpesvirus 3(CyHV-3),and An-guillid herpesvirus 1(AngHV).This virus is a double-stranded DNA virus with a total gene length of abou
6、t 290 kb and contains 156 open reading frames(ORFs).Analysis of the CyHV-2 genome revealed that it contains four TRIM family genes,a family of E3 ubiquitinylated ligases that play an important role in the host immune system,while the role of TRIM protein analogs present in the virus has less been st
7、udied.The function of ORF144,the TRIM analogue of CyHV-2,has not been reported.In this study,the full length of ORF144 gene was obtained by PCR amplification.The recombinant prokaryotic expression vector pET-ORF144,constructed by ligating ORF144 gene with pET-32a,was transformed into competent E.col
8、i cells,and the recombinant protein of about 46 kDa in size was obtained by IPTG-induced expression,which existed mainly as an insoluble inclusion body.The recombinant fusion protein was purified and immunized to BALB/c mice to obtain polyclonal antibodies.The potency of the antibody was greater tha
9、n 151 200 by indirect ELISA,and the antibody was verified by Western Blot to specifically recognize the pro-tein in CyHV-2 infected cells and the purified fusion protein.Indirect immunofluorescence results showed that the protein was localized in the cytoplasm with a punctate distribution.In conclus
10、ion,the ORF144 polyclonal antibody constructed in this experiment can lay the foundation for gene function and pathogenesis study of the virus.Key words:Cyprinid herpesvirus 2;ORF144;prokaryotic expression;polyclonal antibodies CyHV-2 是一种能感染鲫（Carassius auratus）和金鱼（Carassius auratus Linnaeus），导致急性鳃出血
11、并引起高死亡率的病毒病原。该病毒自 1992 年首次在日本发现后1，迅速在全世界传播，在美国2、458 安 徽 农 业 大 学 学 报 2023 年 英国3、中国4、新西兰3和澳大利亚5都有发现。在我国江苏省，仅 2012 年就导致鲫发病面积达 3万 hm2，危害 90%以上养殖区，发病区死亡率 50%以上，造成严重的经济损失6。此后在湖南、江西、浙江、湖北等省7也相继检测到感染CyHV-2的鲫鱼。CyHV-2 属于异疱疹病毒科（Alloherpesviridae）、鲤疱疹病毒属（Cyprinivirus）。该属还包括鲤疱疹病毒 1 型（Cyprinid herpesvirus 1，CyHV-
12、1）、鲤疱疹病毒 3 型（Cyprinid herpesvirus 3,CyHV-3）和鳗鲡疱疹病毒 1 型（Anguillid herpesvirus 1，AngHV）8。该病毒为双链 DNA 病毒，基因全长约 290 kb，共包含 156 个开放阅读框（Open reading frame,ORF）9。研究表明，在 CyHV-2 的基因组中有一组 TRIM（Tripartite-motif protein）家族基因，包含 4 个 ORF（ORF41、128、144 和 150）10。TRIM 家族蛋白属于 E3 泛素化连接酶，其在哺乳动物和脊椎动物中的功能已开展相关研究，但是其在病毒中的功
13、能还研究较少。有研究表明，哺乳动物和鱼类中的 TRIM 家族蛋白在细胞的增殖与分化11、肿瘤的抑制12等方面发挥着调控作用。此外，TRIM 在病毒与宿主的互作中，能通过影响宿主的先天性免疫发挥着对病毒的抑制作用13，但是，对病毒基因组中的 TRIM 蛋白类似物的作用研究较少。本试验选取 CyHV-2 基因组中 TRIM 家族的ORF144 基因开展研究。通过构建原核表达载体获得重组融合蛋白，将蛋白免疫小鼠获得了其多克隆抗体并检测了抗体的效价和特异性，以期为CyHV-2病毒的基因功能和发病机制研究奠定基础。1 材料与方法 1.1 供试材料 CyHV-2 为实验室从患病鲫中分离得到。鲫鳃细胞系（C
14、arassius carassius gill cells,CCG）由本实验室构建。BALB/c 小鼠购自安徽医科大学实验动物中心。pET-32a 质粒、DH5 和 Rosetta（DE3）感受态、病毒提取试剂盒、T4 DNA 连接酶、限制性内切酶等均购自北京全式金生物技术有限公司，DNA 纯化回收试剂盒及 PAGE 胶蛋白微量回收试剂盒购自生工生物工程(上海)股份有限公司。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂和商品化抗体均购自碧云天生物技术有限公司。1.2 引物设计与合成 根据 GenBank（MN201961）上发表的序列，利用 Primer6.0 软件设计 1 对特异性引物扩增全长，序列为 F:
15、5-TTTGGAATTCATGTCCACCTACG-3；R:5-AGTCTCGAGCTTAGAGTATGCTGC-3，划线处分别是 EcoR I 和 Xho I 酶切位点，该引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。1.3 ORF144 基因的克隆 以纯化的 CyHV-2 病毒 DNA 为模板，用合成的特异性引物进行 PCR 扩增，PCR 反应体系为：DNA模板 2 L，10 molL-1上下游引物各 2 L，Prime star Max Premix（2）25 L，灭菌双蒸水 19 L，总体系为 50 L。PCR 反应程序为：95 预变性 5 min；95 变性 30 s，55 退火 30
16、 s，72 延伸 1 min，35 个循环；72 延伸 10 min。将 PCR 产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳后，用胶回收试剂盒回收目的片段并与 pEasy-T1 载体连接，连接产物转化到 DH5 感受态中，PCR 筛选阳性克隆（命名为pEasy-T-ORF144）后送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序验证。1.4 重组原核表达载体的构建 将重组质粒 pEasy-T-ORF144 和 pET-32a（+）载体分别用 EcoR I 和 Xho I 在 37 进行双酶切，2 h 后，酶切产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收目的片段，用 T4 DNA 连接酶 4连接过夜，转化至 Rosetta（DE3）感受态细胞中，PCR 筛选阳性克隆，送至生工生物工程（上海）股份有限公司测序，测序无突变后用于诱导原核表达，重组质粒命名为 pET-ORF144。1.5 融合蛋白的诱导表达 将包含 pET-ORF144 质粒的大肠杆菌 Rosetta接种于含氨苄抗生素的 LB 培养基中，37、200 r min-1振荡培养菌液，待 OD600值达到 0.6 时加入终浓度为 0.5 mmol L-