1、山东医药2023 年第 63 卷第 8 期罗哌卡因对人软骨细胞C28/I2的损伤诱导作用观察及机制探讨刘晨光1，张义华2，曾炼2，罗辉宇2，丁旭东31 锦州医科大学湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院研究生联合培养基地麻醉科，湖北襄阳441000；2 湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院麻醉科；3 湖北医药学院附属襄阳市第一人民医院康复科摘要：目的体外实验观察罗哌卡因对人软骨细胞C28/I2的损伤诱导作用，并探讨相关机制。方法培养C28/I2细胞并分为对照组、实验1组、实验2组、实验3组。实验1、2、3组分别给予0.25、0.50、1.00 mmol/L的罗哌卡因处理48 h；对照组不添加药物。采
2、用CCK-8法检测细胞活力，光学显微镜下观察细胞形态，检测线粒体活性氧（ROS）水平和线粒体膜电位，采用Western blotting法检测细胞中的自噬相关蛋白（LC3、p62）及铁死亡相关蛋白 谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、重组人铁蛋白重链1（FTH1）。结果各实验组细胞存活率低于对照组，且实验1、2、3组细胞存活率依次下降（P均0.05）。对照组细胞呈多边形、三角形等不规则形态，细胞体积大，具有人软骨细胞的结构及特征；各实验组随着罗哌卡因作用浓度增加，软骨细胞数量逐渐减少，细胞形态逐渐变得细长，胞质减少，部分细胞呈球状、皱缩，凋亡、坏死细胞数量增多。实验3组细胞线粒体ROS水平高于对
3、照组，实验1、2、3组细胞线粒体ROS水平依次升高（P均0.05）。对照组、实验1组、实验2组、实验3组LC3-/LC3-依次增加，线粒体膜电位及p62、FTH1、GPX4蛋白表达依次下降（P均0.05）。结论罗哌卡因可诱导软骨细胞发生损伤，降低细胞活力，破坏细胞形态，增强氧化应激，导致线粒体功能障碍，且作用呈剂量依赖性；罗哌卡因对软骨细胞的损伤诱导作用可能与上调细胞自噬水平和诱导铁死亡有关。关键词：罗哌卡因；软骨细胞；细胞活力；铁死亡；自噬doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2023.08.007 中图分类号：R614.3 文献标志码：A 文章编号：1002-266X（
4、2023）08-0029-04Effect of ropivacaine on human chondrocyte C28/I2 injury induction and its mechanismLIU Chenguang1，ZHANG Yihua，ZENG Lian，LUO Huiyu，DING Xudong 1 Department of Anesthesiology，Xiangyang No.1 Peoples Hospital，Jinzhou Medical University，Xiangyang 441000，ChinaAbstract：Objective In vitro ex
5、periments were conducted to observe the injury-inducing effects of ropivacaine on human chondrocytes C28/I2 and to investigate the related mechanisms.Methods C28/I2 cells were cultured and divided into the control group，experimental group 1，experimental group 2，and experimental group 3.Cells in the
6、experimental groups 1，2 and 3 were treated with 0.25，0.50 and 1.00 mmol/L of ropivacaine for 48 h，respectively；no drug was added to the cell in the control group.Cell viability was detected by CCK-8，cell morphology was observed under optical microscope，and mitochondrial reactive oxygen species（ROS）l
7、evels and mitochondrial membrane potential were detected.Autophagy-related proteins（LC3，p62）and ferroptosis-related proteins （glutathione peroxidase 4（GPX4）and ferritin heavy polypeptide 1（FTH1）were detected by Western blotting.Results The cell survival rates of the experimental groups were lower th
8、an that of the control group，and the cell survival rate of the experimental groups 1，2 and 3 decreased successively（all P0.05）.In the control group，the cells showed irregular shape，such as polygon and triangle，and the cells were large，with the structure and characteristics of human chondrocytes.With
9、 the increase of ropivacaine concentrations in all groups，the number of chondrocytes gradually decreased，cell morphology gradually became elongated，cytoplasm decreased，some cells were spherical and shrunken，and the number of apoptotic and necrotic cells increased.The level of mitochondrial ROS in th
10、e experimental group 3 was higher than that in the control group，and the level of mitochon基金项目：湖北省襄阳市医疗卫生领域科技计划项目（2021ZD13；2022YL24B）；襄阳市第一人民医院科研平台专项基金项目（XYY2022P02）。第一作者简介：刘晨光（1996-），男，硕士研究生，主要研究方向为局麻药物毒性。E-mail：通信作者简介：张义华（1969-），男，硕士研究生，主任医师，主要研究方向为围麻醉期呼吸循环的稳定。E-mail：开放科学（资源服务）标识码（OSID）29山东医药2023
11、年第 63 卷第 8 期drial ROS in the experimental groups 1，2 and 3 increased gradually（all P0.05）.The ratios of LC3-/LC3-in the control group，experimental group 1，experimental group 2 and experimental group 3 increased successively，while the mitochondrial membrane potential and protein expression levels of
12、p62，FTH1 and GPX4 decreased successively（all P0.05）.Conclusions Ropivacaine can induce chondrocyte injury，reduce cell vitality，destroy cell morphology，enhance oxidative stress，and lead to mitochondrial dysfunction in a dose-dependent manner.The effect of ropivacaine on chondrocytes may be related to
13、 the up-regulation of autophagy and the induction of ferroptosis.Key words：ropivacaine；cartilage cells；cell viability；ferroptosis；autophagy骨关节炎是由多种原因引起的慢性退行性疾病1，其带来的疼痛和运动障碍影响患者正常生活，最终可导致功能丧失。骨关节炎目前无法根治，治疗目的主要是减轻疼痛、恢复基本的关节活动、避免功能丧失2。关节腔内注射局麻药物被广泛用于骨关节炎及关节手术后镇痛，有助于功能恢复。罗哌卡因作用时间长、毒性小，是临床常用的酰胺类局麻药物3。有研究
14、发现，局部麻醉药物的毒性作用在软骨细胞中也有表现4。罗哌卡因会影响细胞钾通道和钙通道，影响线粒体功能，导致细胞损伤。理论上，适度自噬在线粒体功能受损时起到保护作用，但当自噬超过细胞的最大适应能力时，则会引发线粒体功能障碍，最终导致软骨细胞死亡。自噬还可通过降解铁蛋白、减少铁储存、导致铁“超载”从而促进铁死亡，进一步导致细胞死亡。研究认为，罗哌卡因能够促进神经元细胞发生自噬，但关于罗哌卡因对软骨细胞自噬和铁死亡的影响报道较少。2022年3 月7月，本研究观察了罗哌卡因对人软骨细胞C28/I2的损伤诱导作用，并基于自噬和铁死亡探索相关机制。1 材料与方法 1.1实验细胞与主要材料C28/I2细胞株
15、购于中国科学院上海细胞资源中心。高糖DMEM培养基和胎牛血清购自Gibco公司，罗哌卡因购自辰欣药业公司，CCK-8试剂盒购自Biosharp公司，活性氧试剂盒和 JC-1试剂盒购自凯基生物公司，SDS-PAGE试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司。一抗：GAPDH购自Absin公司，LC3、p62购自三鹰公司、谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）、重组人铁蛋白重链1（FTH1）购自 Cellsignal 公司；HRP 标记的荧光二抗IgG购自杭州碧云天生物公司。酶标仪购自Molecular Devices公司，倒置显微镜购自Olympus公司。1.2细胞分组及处理将C28/I2细胞置于含10%胎牛
16、血清、1%双抗的高糖培养基中，于 37、5%CO2、95%湿度条件下培养。适当换液保持细胞良好状态，待细胞融合达 60%80%时，用胰酶消化细胞，进行传代。将细胞随机分对照组、实验1组、实验2组、实验3组。实验1、2、3组分别给予0.25、0.50、1.00 mmol/L的罗哌卡因处理48 h；对照组不添加药物。1.3细胞活力检测将 C28/12细胞接种到 96孔板，3103/孔，每孔加入 100 L培养基。待细胞状态良好、细胞增殖达60%80%，参照“1.2”分组操作，每组设3个复孔，培养48 h后，每孔加入10 L的CCK-8溶液，37 摇床孵育2 4 h。用酶标仪测定每个孔的光密度（OD）值，以对照组细胞活力为100%，以没有细胞且有CCK-8试剂的空白孔调零，计算各组细胞存活率。细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值100%。1.4细胞形态观察将C28/I2细胞接种于12孔板中，5105/孔，取对数增殖期的细胞进行实验，分组处理方式同“1.2”。培养48 h后，显微镜下选取多个视野，观察各组细胞形态并拍照记录。1.5细胞线粒体活性氧（ROS）及线粒体膜电位检测将C28/I2细胞