1、DOI:10.12131/20220285文章编号：2095 0780（2023）03 0119 10罗非鱼肠系脂滴及相关蛋白提取过程分析李 劼1,2，黄 卉2，相 欢2，岑剑伟2，魏 涯2，赵永强2，郝淑贤2，李来好21.上海海洋大学 食品学院，上海 2013062.中国水产科学研究院南海水产研究所/农业农村部水产品加工重点实验室/国家水产品加工技术研发中心，广东 广州 510300摘要：动植物中的脂质以脂滴(Lipid droplet,LD)的形式存在。掌握脂滴及脂滴相关蛋白(Lipid droplet related protein,LDRP)的提纯方法，对解析鱼类脂质变化及影响机制，寻
2、求适宜的调控途径至关重要。以罗非鱼(Oreochromis niloticus)的肠系脂肪组织为原料，利用离心、重悬及增溶等处理手段分离纯化脂滴及LDRP，并结合SDS-PAGE和质量浓度变化分析提纯效果。结果表明，肠系脂肪组织经3次离心和3次重悬可有效去除杂质，获得较为纯净的脂滴。虽然溶解剂增溶提取的LDRP蛋白浓度较高，但电泳条带存在明显拖尾现象，说明脂质脱除效果不佳，影响了LDRP提取纯度。脱脂增溶需经4组有机溶剂联合处理才可获得纯度高、复溶效果好的LDRP提取样品。离心、干燥方式及脂滴冷冻对LDRP增溶影响差异不显著。关键词：罗非鱼；脂滴；脂滴相关蛋白；提取中图分类号：S 985.1+
3、9文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Extraction process of intestinal lipid droplets and lipid droplet-relatedproteins from tilapiaLI Jie1,2,HUANG Hui2,XIANG Huan2,CEN Jianwei2,WEI Ya2,ZHAO Yongqiang2,HAO Shuxian2,LI Laihao21.College of Food Science and Technology,Shanghai Ocean University,Shanghai 201306,C
4、hina2.South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture and Rural Affairs/National R&D Center for Aquatic Product Processing,Guangzhou 510300,ChinaAbstract:Lipids in animals and plants exist in the fo
5、rm of lipid droplet(LD).It is very important to master the purificationmethods of lipid droplet and lipid droplet related protein(LDRP)for understanding the lipid changes and influence mecha-nisms of fish,and seeking appropriate regulatory approaches.In this paper,the lipid droplet and LDRP were sep
6、arated and puri-fied through centrifugation,resuspension and solubilization by using Oreochromis niloticus intestinal tissues as raw material.The re-sults show that the intestinal adipose tissues were effectively removed by three times of centrifugation and three times of resus-pension to obtain the
7、 pure lipid droplet.Although the concentration of LDRP protein extracted by solubilization was higher,theelectrophoretic bands showed an obvious trailing phenomenon,indicating that the effect of lipid removal was poor,which af-fected the purity of LDRP extraction.Delipidation and solubilization need
8、 to be combined with four groups of organic solventsto obtain the LDRP extracted samples with high purity and good re-solubilization effects.The effects of centrifugation drying第 19 卷第 3 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.32023 年 6 月South China Fisheries ScienceJun.，2023收稿日期：2022-11-01；修回日期：2022-12-18基金项目：国家现代农业
9、产业技术体系(CARS-46)；广东省重点领域研发计划项目(2019B020225001)；中国水产科学研究院基本科研业务费专项资金(2020TD69)；中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助(2020CY03,2021SD06)作者简介：李劼(1998)，女，硕士研究生，研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail:通信作者：郝淑贤(1972)，女，研究员，博士，研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail:李来好(1963)，男，研究员，博士，研究方向为水产品加工与质量安全。E-mail:method and lipid droplet freezi
10、ng on LDRP solubilization were not significantly different.Keywords:Oreochromis niloticus;Lipid droplet;Lipid droplet-related protein;Extraction水产品在加工和贮藏过程中，其脂质变化显著。脂质通过水解、氧化等反应，一般会生成风味物质，但也会产生大量不良物质，而这些物质可作为评价水产品营养和安全的指标1-2。以往对于水产品脂质的研究多基于整体脂质和脂肪酸的组成和含量3-4。近期大量研究发现脂质以脂滴(Lipiddroplet,LD)的形式存在。脂滴不再是人
11、们传统认知的惰性细胞器，而是一种高度复杂、进化稳定，几乎存在于所有动植物当中的动态细胞器。脂滴在细胞内有维持细胞能量稳定、保护细胞不受脂毒性物质侵害等作用5。同时，脂滴与其他细胞器也有密切的相互作用6-7，如脂滴和线粒体的紧密接触便于疏水性脂肪酸从脂滴转运到线粒体8，内质网合成模型显示脂滴在内质网小叶上合成9-10。脂滴是细胞中常见的重要细胞器，脂滴包被的单层磷脂膜上镶嵌着多种蛋白，如“PAT”家族蛋白5,11，脂滴的中性脂质核心也存在许多蛋白12。在脂滴表面和内部的蛋白被统称为脂滴相关蛋白(Lipid droplet-related protein,LDRP)。不同 LDRP之间的差异会影响
12、脂滴在细胞中的功能13，脂滴的完整性对脂质代谢具有重要意义14。脂滴出现聚集或者是数量变化，与脂质的合成或吸收有密切关系15；脂质成分在降解之前，LDRP 发生降解16-17。目前关于脂滴的研究主要集中在微生物、植物及畜禽类动物6,18-20。密度梯度离心法是脂滴提取的常用方法，其原理是先通过低速离心去除颗粒较大的杂质，使脂滴聚集；再利用不同密度缓冲液进行高速离心，使脂滴和杂质彻底分离。通常依据离心次数分为两步离心法21-22和三步离心法23-24，二者均在最后一次离心中加入不同密度的缓冲液，利用高速离心使脂滴和杂质彻底分离。不同物种提取脂滴的条件不同，需要针对样品种类和特性进行调整25。目前
13、，关于水产动物脂滴的研究较少，分析脂滴提取过程和影响因素的研究尚未见报道。罗非鱼是我国主要的经济鱼类，其脂质在加工及贮藏过程中的变化一直是加工企业及科研工作者关注的焦点。掌握鱼类脂滴及 LDRP 提纯方法，对解析鱼类脂质变化及影响机制，寻求适宜的调控途径至关重要。1 材料与方法 1.1 材料与试剂鲜活罗非鱼(400600 g)购自广州超市。三甲基甘氨酸(Tricine)、4%(体积分数)多聚甲醛通用型固定液购自兰杰柯科技有限公司；Bradford 蛋白浓度测定试剂、Bradford 蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE 蛋白上样缓冲液(5)、考马斯亮蓝染色液、BeyoColor彩色预染蛋白(1
14、0170 kD)购于上海碧云天生物技术有限公司；NUPAGE 12%(体积分数)Bis-Tris 蛋白预制梯度胶板(厚 1.0 mm、15 孔)、NUPAGE MES SDS 缓冲液(20)购于英潍捷基(上海)贸易有限公司；二甲基亚砜、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)、苯甲烷磺酰氟(PMSF)、十二烷基磺酸钠(SDS)购于北京索莱宝科技有限公司。二甲苯、中性树胶购于国药集团化学试剂有限公司；环保脱蜡液、HE 染液、油红染液、苏木素染液分化液、返蓝液、甘油明胶封片剂 购于武汉赛维尔生物科技有限公司。其他均为实验室常用试剂。1.2 试剂配制配制磷酸盐缓冲液(PBS)、蔗糖溶液(2.5molL1)
15、。苯甲基磺酰氟(PMSF)(0.2 molL1)：将 0.35 gPMSF 溶解于 10 mL 二甲基亚砜，20 下避光保存。缓冲液 A(Buff A)：1.79 g Tricine 用 400 mL 去离子水溶解，用氢氧化钾(KOH)调 pH 至 7.8；加入 50 mL 蔗糖溶液(2.5 molL1)，定容至 500 mL。缓冲液 B(Buff B)：0.95 g HEPES、1.49 g 氯化钾(KCl)和 0.038 g 氯化镁(MgCl2)，用 180 mL 去离子水溶解，用 KOH 调 pH 至 7.4，定容至 200 mL。1.3 仪器与设备H1850R 冷冻离心机(湖南湘仪公司
16、)；IKA-T25 均质机(德国 IKA 公司)；D1008E 掌上离心机 大龙兴创实验仪器(北京)股份公司；SYN-ERGY/H1 酶标仪(美国伯腾公司)；Alpha1-4 冷冻干燥机(德国 Christ 公司)；DYY-6C 型电泳仪(北京六一生物科技有限公司)；Mini Gel TankPAGE 电泳系统、CRYOSTAR NX5O 冰冻切片机(美国赛默飞科技公司)；J-12J 脱水机、JB-P5 包埋机、JB-L5 冻台(武汉俊杰电子有限公司)；RM2016120南 方 水 产 科 学第 19 卷病理切片机、LEICA 819 切片刀(上海徕卡仪器有限公司)；KD-P 组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司)；Nikon Eclipse E100 正置光学显微镜、NIKON DS-U3 成像系统(日本尼康)；其他均为实验室常用设备。1.4 方法1.4.1肠系脂肪样品处理参考 Tian 等23的方法并稍加改动。取罗非鱼肠系脂肪，用 PBS 洗涤 3 次，沥干水分，备用。1.4.2肠系脂肪 H&E 染色与观察参考 Tian 等23和崔留娟26的方法并进行调整。取肠系脂肪用 4