1、第 34 卷第 2 期陇 东 学 院 学 报Vol34No22023 年 3 月Journal of Longdong UniversityMar 2023文章编号:1674-1730(2023)02-0106-06收稿日期:2022-03-19基金项目:甘肃省自然科学基金项目(18J3M237);兰州大学“细胞活动与逆境适应教育部重点实验室”开放基金项目(lzujbky 2020 kb05);陇东学院青年科技创新项目博士研究专项(XYBE1602);陇东学院细胞生物学 “课程思政”示范课程建设项目作者简介:杨建霞(1972)，甘肃镇原人，博士，副教授，主要从事植物分子生物学、药用植物活性成分
2、研究工作。酶解法提取葡萄叶白藜芦醇及抑菌活性研究杨建霞1，2，师雪梅2，曹源沅2，王海燕2(1 甘肃省陇东生物资源保护利用与修复重点实验室，甘肃 庆阳 745000;2 陇东学院 生命科学与技术学院，甘肃 庆阳 745000)摘要:探索酶解法提取葡萄叶中白藜芦醇的最佳工艺，对农业废弃物的高效转化具有重要贡献。以葡萄叶为原料，采用酶解法提取白藜芦醇，并利用单因素及正交试验优化从葡萄叶中提取白藜芦醇的最佳工艺和研究提取物抑菌活性。结果表明:(1)酶解法提取葡萄叶白藜芦醇的最佳工艺条件为酶添加量 0 8%、提取时间 6 h、提取温度 45、料液比 1 15，提取率最高达 2 65%。(2)采用滤纸片
3、法测定葡萄叶白藜芦醇的抑菌作用，发现当白藜芦醇浓度为 41 102mg/mL 时对金黄色葡萄球菌、产气肠杆菌、变形杆菌、枯草芽孢杆菌及沙门氏杆菌均具有较好的抑菌效果;通过最低抑菌浓度 MIC 测定，发现葡萄叶白藜芦醇提取液对金黄色葡萄球菌的 MIC 为 41 105mg/mL，对产气肠杆菌的 MIC 为 41 104mg/mL，对变形杆菌和枯草芽孢杆菌的 MIC 为 41 102mg/mL，而对沙门氏杆菌的 MIC为41 101mg/mL。最终确定葡萄叶白藜芦醇对5 种细菌的抑菌作用大小依次为:金黄色葡萄球菌 产气肠杆菌 变形杆菌=枯草芽孢杆菌 沙门氏杆菌。酶解法可以有效地提取葡萄叶白藜芦醇，
4、葡萄叶白藜芦醇具有较好的抑菌作用，在天然抑菌剂的开发及应用方面具有广阔的发展前景。关键词:葡萄叶;白藜芦醇;酶解;最低抑菌浓度 MIC;抑菌性中图分类号:TS202 3文献标识码:AStudy on Extraction Technology and Antibacterial Activity of esveratrolfrom Vitisvinifera Leaves by Enzymolysis MethodYANG Jian-xia1，2，SHI Xue-mei2，CAO Yuan-yuan2，WANG Hai-yan2(1 Key Laboratory for Protection
5、and Utilization of Longdong Bio-resources in Gansu Province，Qingyang 745000，Gansu;2 College of Life Science and Technology，Longdong University，Qingyang 745000，Gansu)Abstract:To explore the optimal extraction technology of resveratrols from Vitisvinifera leaves by enzymolysis，ithas important contribu
6、tion to transform agricultural waste efficiently Using Vitisvinifera leaves as raw materials，theextraction process of resveratrols from grape leaves was optimized by single factor experiment and orthogonal designtest，and its antibacterial activity is determined by filtering paper method These result
7、s showed that the optimal ex-traction conditions as follows:enzyme additive amount is 0 8%，extraction time is 6h，extraction temperature is45，solid-liquid ratio is 1 15，and the extraction yield of resveratrols from Vitisvinifera leaves is 2 65%The an-tibacterial activity of resveratrols is determined
8、 by filtering paper method It is found that resveratrols have obviousinhibitory effect on Staphylococcus aureus Enteroaerogen，Proteus，Bacillus subtilis，and Salmonella at 41 102mg/mL Then，it is also found that resveratrols have minimal inhibitory concentration on Staphylococcus aureusat 41105mg/mL，it
9、 have MIC on Enterobacteraeriformis at 41 104mg/mL，it have MIC on Bacillus subtilis and Pro-第 2 期杨建霞，等:酶解法提取葡萄叶白藜芦醇及抑菌活性研究teus at 41 102mg/mL，respectively，and it have MIC on Salmonella at 41 101mg/mL The antibacterial activityof resveratrol on 5 kinds of bacteria was as follows:Staphylococcus aureus
10、 Enterobacteraerogenes Proteus=Ba-cillus subtilis Salmonella The resveratrols from Vitisvinifera leaves can be effectively extracted by enzymolysismethod It has antibacterial effects and broad prospects in the application of natural antibacterial agentsKey words:Vitisvinifera leaves;resveratrols;enz
11、ymolysis;minimal inhibitory concentration;antibacterial activity葡萄(Vitisvinifera)为葡萄科葡萄属的木质藤本植物，果实球形或椭圆1。是一类老少皆宜的时令水果，有开胃健脾、补益气血、强健筋骨等作用。我国葡萄资源十分丰富，果实被用来制作葡萄酒、葡萄醋、果汁以及果酱，晾干后可作葡萄干，然而葡萄叶并没有得到很好地开发利用，每年葡萄采收后绝大部分葡萄叶被焚烧或丢弃烂掉在果园，只有少部分被制成饲料，造成了葡萄资源的大量浪费，而且会危害环境。许多研究表明不但葡萄皮中富含白藜芦醇，而且葡萄其他部位也含有白藜芦醇2 6。白藜芦醇是一种
12、天然的、可食用的多酚类化合物，主要存在于何首乌、虎杖、葡萄、桑葚等多种植物中，白藜芦醇具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗菌等多种药理作用2 5。许多学者通过体外抗菌实验证明了白藜芦醇对多种葡萄球菌、绿脓杆菌、肺炎双球菌、痢疾杆菌等具有较强的抗菌效果2 17，3，但关于白藜芦醇对常见的消化道类致病菌如产气肠杆菌、沙门氏杆菌等的集中研究则相对较少。白藜芦醇的提取方法有好多种，其中酶提取法中的纤维素酶、果胶酶混合处理可以使植物的细胞壁受到损坏，使细胞中重要的目标产物充分地释放出来，更利于提取相关有效成分 4 5。本实验的目的在于建立有效的从葡萄叶中提取白藜芦醇的工艺并测定其含量，有效拓展葡萄叶的应用，从中
13、获得良好的经济效益。因此本研究以葡萄叶为原料，利用酶解法提取其中的白藜芦醇，并进行抑菌试验研究，以期为其在食品、医药、化工等领域的应用提供理论依据。不但对农产品的深加工和增加高附加值以及农产品的综合利用拓宽了思路，也对农业废弃物的高效转化具有重要贡献，以此可以获得较好的经济效益及社会效益。1材料与方法1 1材料供试葡萄树品种为“户太 8 号”，葡萄叶片于2021 年 9 月采自庆阳市镇原县通远果业专业合作社葡萄园。供试菌株:金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、产气肠杆菌、枯草芽孢杆菌、变形杆菌(均由陇东学院微生物实验室保存)。1 2试剂与仪器白藜芦醇(B 级，纯度，98 0%，上海生工试剂);纤维素酶
14、(酶活45U/mg，上海生工试剂);果胶酶(源自黑曲霉，酶活20U/mg，上海生工试剂);95%乙醇(天津大茂试剂厂);二氧化碳培养箱(HM CP-T，上海福玛实验设备有限公司)。台式高速冷冻离心机(H/T16M，湖南赫西仪器装备公司);紫外 可见分光光度计(UV 5100B，上海元析仪器公司);电热恒温水浴锅(HH-S6A，北京科伟永兴仪器公司);立式压力蒸汽灭菌器(18J 06303，江阴滨江医疗设备公司);真空干燥箱(DZF 6020，上海琅轩实验设备公司);超净工作台(SW-CJ-TF，苏州苏洁净化设备公司);手动移液器(德国艾本德);电子天平(ES 202，北京塞多利斯仪器系统公司)
15、。1 3实验方法1 3 1培养基的制备6 39牛肉膏蛋白胨培养基由牛肉膏 5 0g、蛋白胨10 0g、Nacl5 0g、琼脂 20 0g，加水溶解至 1000mL(用 HCL 或者 NaOH 调至 PH 为 7 0)。1 3 2菌种的活化及菌液的制备6 40 41将冰箱中保存的菌种取出置于室温条件下，使其解冻，用已灭菌的接种环在超净工作台上挑取适宜的菌落置于事先盛有无菌水的试管中制备菌悬液。在超净工作台上，用移液枪吸取 50L 的菌悬液滴于牛肉膏蛋白胨的固体培养基上，以划线法接种于培养基上。将接种好的培养基置于温度为28的生化培养箱中培养 24h，即完成活化。将菌种复苏后，接种至固体培养基上，
16、28 培养 24h，计数菌落数，用灭菌的 0 85%生理盐水稀释菌悬液，调整细胞个数至 2 108CFU/mL，备用。1 3 3酶解法提取葡萄叶白藜芦醇1 3 3 1白藜芦醇粗提物制备参照葛维娟等7 的方法并作适当改变。将新鲜的葡萄叶洗干净后放入真空干燥箱中，在 105，701陇 东 学 院 学 报第 34 卷15min 下杀青，之后置于 80的干燥箱中过夜烘干，之后用组织捣碎机全部粉碎，装袋备用。按实验要求准确称取 2 00g 粉碎好的葡萄叶粉末，倒入250mL 锥形瓶中，加入一定量的纤维素酶和果胶酶混合液、一定量的 70%乙醇，置于恒温水浴锅中酶解提取，冷却至室温纱布过滤，弃去沉淀，保留滤液，将滤液二次过滤后收集，将其置于 10mL 离心管放入冷冻高速离心机中，常温，4000r/min，离心10min，收集上清液，测定白藜芦醇的提取率。1 3 3 2白藜芦醇的鉴定采用三氯化铁 铁氰化钾溶液显色反应和氨水显色反应，可鉴定葡萄叶提取物的有效成分为白藜芦醇8 195。1 3 3 3白藜芦醇标准曲线的制作及提取率的计算8 197以白藜芦醇(98 0%的标准品)绘制标准曲线，得线性回归方程: