1、 实 验 技 术 与 管 理 第 40 卷 第 4 期 2023 年 4 月 Experimental Technology and Management Vol.40 No.4 Apr.2023 收稿日期:2022-11-04 基金项目:哈尔滨工业大学研究生教育教学改革研究项目（22MS046）；黑龙江省高等教育教学改革项目（SJGY20220055）及“分子免疫学多轨道改革与实践研究”作者简介:顾宁（1973），男，黑龙江哈尔滨，博士，教授，主要从事药理毒理学与内分泌疾病领域的研究，。通信作者:韩放（1978），女，黑龙江哈尔滨，博士，副教授，主要从事肿瘤细胞分子生物学领域的研究，。引文格
2、式:顾宁，曲有鹏，朱瑞娇，等.面向非生物学专业的 CRISPR/Cas9 基因编辑实验教学的设计与实践J.实验技术与管理,2023,40(4):187-191.Cite this article:GU N,QU Y P,ZHU R J,et al.Design and practice of CRISPR/Cas9 gene editing experiment teaching for non-biological majorsJ.Experimental Technology and Management,2023,40(4):187-191.(in Chinese)ISSN 1002-4
3、956 CN11-2034/T DOI:10.16791/ki.sjg.2023.04.028 面向非生物学专业的 CRISPR/Cas9 基因编辑 实验教学的设计与实践 顾 宁，曲有鹏，朱瑞娇，王长林，宋金柱，韩 放（哈尔滨工业大学 生命科学与技术学院，黑龙江 哈尔滨 150001）摘 要：文章以 CRISPR/Cas9 基因编辑技术为基础，设计了面向非生物专业学生的“利用基因编辑技术建立靶基因敲除细胞系”实验课程。实验包括验证性和探索性内容，整合了生物信息学、分子生物学、细胞生物学、基因工程等多学科知识点，有利于加强学生对相关生命科学知识的理解，有利于提高学生综合实验设计能力和培养创新精神
4、。关键词：CRISPR/Cas9；基因编辑；创新性实验；教学改革 中图分类号：Q-33；G642.0 文献标识码：A 文章编号：1002-4956(2023)04-0187-05 Design and practice of CRISPR/Cas9 gene editing experiment teaching for non-biological majors GU Ning,QU Youpeng,ZHU Ruijiao,WANG Changlin,SONG Jinzhu,HAN Fang(School of Life Science and Technology,Harbin Insti
5、tute of Technology,Harbin 150001,China)Abstract:Based on CRISPR/Cas9 gene editing technology,an experimental course of“Using gene editing technology to establish target gene knockout cell lines”was designed for non-biological students.The experiment includes confirmatory and exploratory content,inte
6、grating multidisciplinary knowledge points such as bioinformatics,molecular biology,cell biology,genetic engineering.It is conducive to strengthening students understanding of relevant life science knowledge,improving their comprehensive experimental design ability and cultivating their innovative s
7、pirit.Key words:CRISPR/Cas9;gene editing;innovative experiments;teaching reform CRISPR/Cas 系统是一种细菌、古生菌等原核生物抵御外界病毒入侵的天然免疫系统1。2012 年科学家第一次证实在双链 RNA 的指导下，Cas9 蛋白可以切割双链 DNA2，2013 年华人科学家张锋用 CRISPR/Cas9 系统在大肠杆菌中实现了基因组编辑3，使得CRISPR/Cas9 基因编辑技术得以快速发展及应用。2020 年，诺贝尔化学奖被授予发现 CRISPR 基因编辑技术的两位科学家，自此，更多的研究人员和大专院校学
8、生对此产生了浓厚的兴趣。将交叉学科前沿知识以及常用技术手段引入实验教学是实验教学改革的重要方向4-5。目前，国内已有部分高校将CRISPR/Cas9技术引入生物学专业实验教学，教学效果良好6-8。基于国家创新型人才培养战略目标以及学科交叉的大趋势9，我校结合课程特点和学生意愿，面向非生物学专业学生开设了名为“利用基因编辑技术建立基因敲除细胞系”的实验课程。面188 实 验 技 术 与 管 理 向非生物学专业学生开设此课程，旨在使他们在学习本专业知识的同时，能够由点及面地了解生命科学的最新科研动态，培养多学科交叉思维，提高创新能力。1 实验教学设计 根据课程特点以及学生现有的知识基础，选取小鼠的
9、经典生物钟基因 Bmal1 为目的基因。该基因共包括 24 个外显子，其表达产物 BMAL1 可以维持生物节律的稳定，调节哺乳动物的代谢等生理功能10。大量研究表明，生物钟基因对骨骼肌的发育、分化以及代谢等过程具有重要作用11。例如，Bmal1 的缺失会引起纤维型移位、肌节结构改变、线粒体体积减小等肌肉病理反应12。本实验选择在 C2C12 细胞系中敲除Bmal1 基因，通过观察 C2C12 细胞的分化形态，直观、简便地观察基因编辑效果。该实验流程比较复杂，让生物基础知识储备不足的非生物专业学生独立进行研究型实验设计不现实，因此本实验设计采取了验证性与探索性相结合的方式。1.1 实验材料与主要
10、试剂 实验材料：C2C12 细胞系，pSpCas9(BB)-2A-GFP（pX458）。主要试剂：胎牛血清，马血清，DMEM 培养基，胰蛋白酶，TOP10 感受态细胞，Bbs I，PBS 缓冲液，LB 培养基，氨苄青霉素。1.2 实验流程 1）设计 sgRNA。首先，登录 NCBI 网站（https:/www.ncbi.nlm.nih.gov/），在 All Databases 下拉框中选择 Nucleotide，输入 mouse Bmal1（种属基因名称）并搜索，选择基因序列，找到 CDS 区并复制 CDS 区序列。然后打开sgRNA 设计网站（http:/crispr.dbcls.jp/）
11、，在粘贴核苷酸序列框中粘贴 CDS 区序列，PAM 序列选择 NGG，种属来源选择 mouse，点击 design，选择高评分的sgRNA 序列，在正向序列 5末端添加序列“cacc”，在反向序列的 5末端添加序列“aaac”，这两小段序列分别与经 Bbs I 内切酶切割之后的质粒载体的粘性末端互补，然后将这两条 sgRNA 送去生物公司合成。如果正向 Oligo 的第一个碱基不是“G”，需要自行添加一个碱基“G”，即在正向序列 5末端添加序列“caccg”，相应的反向序列 3端添加一个碱基“C”，5末端仍然添加序列“aaac”。本实验中选择的 sgRNA 的序列如表 1 所示。2）构建质粒载
12、体。（1）单链 Oligo 的退火。利用 ddH2O 将 4 条 Oligo 稀释到浓度为 100 M，然后于 NEBuffer 2 中混合稀释，此时 Oligo 浓度为 25 M。将上述混合体系于 PCR 表 1 sgRNA 的序列 引物名称 序列（5-3）Bmal1-sg-F1 caccGGCCCCACCGACCTACTCTC Bmal1-sg-R1 aaacGAGAGTAGGTCGGTGGGGCC Bmal1-sg-F2 caccGTGTGGACTGCAATCGCAAG Bmal1-sg-R2 aaacCTTGCGATTGCAGTCCACAC 仪中反应，反应条件为 95，1 min(1
13、cycle)；95，2 min(4 cycles)；95，3 min(1 cycle)。在反应 10 min时从 PCR 仪中取出，再置于室温缓慢冷却 12 h，形成 DNA 双链。反应体系如表 2 所示。（2）酶切。按照表 3 配成反应体系，放入水浴锅中，在 37 下保持 3 h。（3）连接。按照表 4 的反应体系，过夜连接。（4）转化。将表 4 中 20 L 的连接产物加入到感受态细胞中，冰上静置 30 min，然后在 42 水浴锅中热激 1 min，立即置于冰上 2 min。加入 SOC 培养基，在 37 恒温摇床培养 40 min，低速离心之后弃部分上清，将剩余培养基重悬感受态，将重悬
14、液涂布于含有Amp的平板上，在37 恒温箱中倒置过夜培养。表 2 单链 Oligo 的退火反应体系 名称 体积/L Bmal1-sg-F 5 Bmal1-sg-R 5 NEBuffer 2 2 ddH2O 8 表 3 酶切反应体系 名称 体积/L pX458 x(1 ng)ddH2O 44-x 10NEBuffer 5 Bbs I 1 表 4 连接反应体系 名称 体积/L pX458(20 ng/L)7 退后的 sgRNA 3 连接酶 10 3）转化子的菌落 PCR 鉴定。要求每位学生选取 1 个单菌落进行 PCR 鉴定，PCR 体系如表 5 所示。将经过 PCR 验证为阳性条带的克隆进行摇菌
15、扩大培养。4）细胞转染。将上述扩大培养的阳性克隆提取质粒用于细胞转 顾 宁，等：面向非生物学专业的 CRISPR/Cas9 基因编辑实验教学的设计与实践 189 表 5 单菌落 PCR 反应体系 名称 体积/L 2Es Taq Mix 5 pX458-seq(5 M)0.8 Bmal1-sg-R(5 M)0.8 含单克隆菌落的 ddH2O 2 ddH2O 1.3 染。采用电穿孔方式，使外源质粒通过高强度的电场作用穿过细胞膜进入 C2C12 细胞。质粒中含有 Cas9基因，表达 Cas9 蛋白并发挥作用。同时，质粒载体中含有 gfp 基因，可以观察到绿色荧光，从而确定转染效率。5）阳性克隆的筛选
16、。（1）克隆培养。对计数转染 24 h 后的细胞，使每100 L 培养基中只含有一个细胞，然后在 96 孔板的每个孔中加入 100 L 培养基，培养一周左右。（2）单克隆扩大培养。培养过程中要注意及时换液并观察，标出单克隆的孔，待单克隆长到孔底的 1/5时，传代至 12 孔板中扩大培养，待细胞生长到对数期，消化传代 4/5 提取 DNA，剩余 1/5 继续培养。通过蛋白质免疫印迹以及测序等方法鉴定所有等位基因为无效突变后，克隆为敲除细胞。将鉴定为阳性的克隆传代扩大培养，冻存留种用于后续实验。2 实验结果与讨论 2.1 菌落 PCR 鉴定结果 首先，向学生讲解实验流程和注意事项并做演示，之后请参加实验的 8 位学生分别选取单菌落，同样条件下进行菌落 PCR，琼脂糖凝胶电泳结果如图 1 所示。可以看到，第 5 位学生的结果没有 DNA 条带，自己分析原因是选取单菌落时牙签没有挑到单菌落，也不确定样品是否点进孔内。根据这些实验结果采用互动式教学，教师通过提问引导学生及时解决实验中遇到的问题，启发他们自主思考，培养解决问题的能力。图 1 8 位学生的单菌落 PCR 结果 当学生熟悉操作流程并亲