1、 南京农业大学学报，（）：收稿日期：基金项目：国家自然科学基金项目（）；中央高校基本科研业务费专项资金（）作者简介：李紫彤，硕士研究生。通信作者：王先炜，教授，主要从事动物传染病的教学与研究，：。李紫彤，赵晨遥，朱慧欣，等 米非司酮的抗伪狂犬病毒作用及其与氢醌的协同效应 南京农业大学学报，（）：，（）：米非司酮的抗伪狂犬病毒作用及其与氢醌的协同效应李紫彤，赵晨遥，朱慧欣，蓝培如，王先炜（南京农业大学动物医学院 农业农村部动物疫病诊断与免疫重点开放实验室，江苏 南京）摘要：目目的的 本试验探究药物米非司酮的抗伪狂犬病毒（）作用及其与另一种抗伪狂犬病毒药物氢醌的协同作用，为抗 药物的研究和临床应用
2、奠定基础。方方法法 用 和 等方法检测米非司酮及其与氢醌联用在体外对伪狂犬病毒复制的影响及其影响的作用阶段，再通过小鼠攻毒保护试验进一步确认其抗病毒作用及与氢醌联用的协同作用。结结果果 米非司酮具有抗病毒作用，且随着浓度升高而增强，此作用发生于伪狂犬病毒复制早期。体内、体外试验结果表明，米非司酮（体内 、体外 ）单独或与氢醌（体内 、体外 ）联用均具有抗病毒作用，与氢醌具有协同抗病毒作用，同时能减轻单独用药对肝脏的损伤。结结论论 米非司酮在病毒复制早期发挥抗病毒作用，与氢醌的联用具有更好的抗病毒效果，既减轻氢醌对肝脏的损伤，又弥补米非司酮药效上的不足。关键词：猪伪狂犬病毒；米非司酮；抗病毒；氢
3、醌；协同效应中图分类号：文献标志码：文章编号：（），（，）：，（，）（，），：（）；伪狂犬病毒（，）属于疱疹病毒科 疱疹病毒属，与其他 疱疹病毒一样，可以引起潜伏感染，且对多数动物易感。伪狂犬病是由 感染猪引起的一种急性传染病。临床上因传染源难以控制，也无有效治疗药物，故防治困难，给我国乃至世界养猪业均带来巨大经济损失。在 年以前，该病主要依赖疫苗进行防控，但因变异毒株的出现导致疫苗的免疫效果下降。因此，研发抗病毒药物成为有效防控该病的一个方向。米非司酮（，）是一种 去甲睾酮衍生物，是强力的抗孕激素和抗糖皮质激素药，也是第一个用于人类流产的孕激素和糖皮质激素的活性拮抗剂，对孕激素和糖皮质激素受
4、体具有高亲和 第 期李紫彤，等：米非司酮的抗伪狂犬病毒作用及其与氢醌的协同效应力，的 位的苯基氨基二甲基可与上述受体特定区域发生相互作用导致受体构象发生改变，影响受体的相关功能。与相关受体结合产生抑制剂效应，但 与受体的结合还可以转化为激动剂效应，这种转化依靠机体其他信号通路干扰调节实现。至今已投入使用约 年，多应用于产科类疾病，也在向其他学科拓展，如 在脑膜肿瘤治疗中的应用。有研究显示 可促进 复制，但其抗病毒活性尚未见报道。本课题组前期研究发现米非司酮对 的复制有一定抑制活性。基于此，本试验对其抗病毒作用进行深入研究，再通过体内外试验研究其与氢醌的协同抗 作用，为抗 药物的研发和应用奠定基
5、础。材料与方法 试验材料由小鼠脑组织分离的神经母细胞 由本实验室保存。伪狂犬病毒 毒株（：）由本实验室分离并保存。米非司酮（）、氢醌（，）购自 公司，药物均用二甲基亚砜（）溶解；培养基购自美国 公司；新生胎牛血清购自南美 公司；反转录试剂、购自南京诺唯赞公司；鼠单抗购自 公司；、（）抗体购自 公司；抗体购自 公司；（）购自 公司；标记的山羊抗小鼠抗体、检测试剂、蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天公司；、试剂提取试剂盒购自美国 公司；伪狂犬病毒 蛋白鼠单克隆抗体、（）全基因重组质粒、抗体由本实验室制备并保存。体重约 周龄 小鼠购自扬州大学动物繁育中心。药物抗病毒效力验证将 细胞铺于 孔板，待细胞长
6、至铺满孔底约 时，加入 终浓度为 的（稀释）；并设置阴、阳性对照（接种病毒）。预处理 后接种 （感染复数 ）的，吸附 后弃病毒液，加入 含有终浓度为 的维持液（含），培养 ；和 检测 毒株的复制情况。检测 蛋白表达弃去细胞板内液体，用 预冷 洗涤 次，加 蛋白裂解液后置冰上裂解 ，每 摇晃 次，使细胞充分裂解；、离心 ；取上清液，用 蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度；根据所测得蛋白浓度进行定量，加入商品化 电泳加样缓冲液，水浴 ；电泳分离蛋白，利用电转印仪转印硝酸纤维素膜。脱脂乳室温封闭 ；洗膜 次，每次 ；加 单抗（）与内参 鼠单抗（）室温孵育 ；洗膜 次，用羊抗鼠（）孵育 ；将发光显色液均匀涂于
7、硝酸纤维素膜表面，置于蛋白曝光仪上曝光成像。检测 基因弃去细胞板内液体，预冷 洗涤 次，裂解细胞，用 提取。按照 反转录说明书反转录（）成。体系 ，包括：，（总量为 ）。反应程序：，。获得的 置于 保存备用。以 为模板，进行 扩增。基因对应引物对序列：，）；，。反应体系（）：，上游引物，下游引物，。反应程序：，；，个循环；，。以 为持家基因，通过相对荧光定量 检测各试验组和对照组中 表达水平。相对表达量按 法计算：，（药物处理组 药物处理组）（病毒对照组 病毒对照组）。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷 药物对细胞毒性的测定将 细胞铺于 孔板，待细胞长满单层 ，弃去培养液，加入 洗涤细胞。用
8、含 胎牛血清（）的细胞培养液稀释，使药物终浓度分别为、和 ，培养；同时设定 为阴性对照。加入 预冷 洗涤 次。按 检测试剂盒说明书进行操作，使用多功能酶标仪检测 值，计算不同浓度 作用下的 细胞活力，通过 计算 在细胞上的半数安全浓度（）。不同浓度米非司酮对 的抑制作用按 节方法用不同浓度 处理细胞后接种病毒，培养 。收取细胞培养液样品，用 提取 ，检测各组 的表达水平。米非司酮抗病毒作用发生阶段的检测 米非司酮对 吸附的影响 将 细胞铺于 孔板，待细胞长满单层，加入终浓度为 ，培养 ，接种 的，吸附 ，弃去病毒液，加预冷的 洗涤 次。提取，检测各组 的表达水平。米非司酮对 入胞的影响 向长满
9、单层 的 细胞中加入 ，洗涤细胞，接种 的，吸附 ，弃病毒液，洗涤后加入 终浓度为 的，于 、孵育 ，用冷的柠檬酸缓冲液洗涤细胞 次。提取，检测各组 的表达水平。米非司酮对 复制的影响 向长满单层 的 细胞中加入 洗涤细胞，接种 的，孵育，弃病毒液，加入预冷的柠檬酸缓冲液洗涤 次，再加入 含终浓度为 的 维持液，分别培养 和 ，提取，检测各组 的表达水平。米非司酮与氢醌对 的抑制作用长满单层 的 细胞分别用米非司酮（终浓度 ）、米非司酮氢醌（终浓度均为 ）、氢醌（终浓度 ）处理 后接种 的；同时设置阴、阳性对照。培养 ，收取样品，进行 。小鼠攻毒保护试验及脏器病毒载量测定 攻毒保护试验 将 溶
10、于玉米油（乙醇助溶）、溶于生理盐水，保存备用。将 只小鼠随机均分为 组：氢醌组、米非司酮组、联合用药组、攻毒对照组以及空白对照组（每组 只，只用于观察并统计死亡率，只用于宰杀、取样）。给药组与攻毒组每只小鼠背部皮下接种 ，空白对照组背部皮下注射等体积的。攻毒 后，将保存的药物涡旋 ，分别以 、对氢醌组和米非司酮组小鼠进行腹腔注射和皮下多点注射，联合给药组以同样剂量和注射方式给药，攻毒对照组与空白对照组注射等量的玉米油和生理盐水。每隔 注射 次直至攻毒后 。每天观察小鼠的食欲、精神以及临床表现，统计每组的死亡率。攻毒 后每组随机取 只小鼠，宰杀并解剖，观察小鼠的脏器病变，取其脑、肺、肝，测定其病
11、毒载量。组织脏器病毒载量测定 称取 待检组织，加入 后匀浆，反复冻融 次，、离心 ；取上清液，用 提取脏器中 ，保存、备用。检测组织脏器中病毒载量方法同 节。结果与分析 药物抗病毒效果的验证收取样品进行 和。图 显示：在 米非司酮的作用下，蛋白表达水平显著下降（图），表达水平也显著下降（图），说明米非司酮在细胞中对 的复制有一定抑制作用。米非司酮对细胞的毒性作用为了检测米非司酮对细胞的毒性，评估其安全性以及应用前景，使用商品化 试剂盒检测药物作用下的细胞活性。结果显示：米非司酮能杀死半数 细胞，随着浓度的增加，细胞活力降 第 期李紫彤，等：米非司酮的抗伪狂犬病毒作用及其与氢醌的协同效应低。根据
12、绘制的曲线计算出米非司酮的 为 。图 米非司酮（，）对伪狂犬病毒（）的抑制作用.（，）（）检测 蛋白表达水平 ；检测 表达水平 “”“”分别表示添加和不添加该物质“”“”：阳性对照，接种 ，；：；：阴性对照，正常 细胞 ，下同 图 米非司酮对 细胞的毒性作用.图 不同浓度米非司酮抑制 增殖的剂量效应.不同浓度米非司酮对 的抑制作用为了探究米非司酮对 的抑制作用是否存在剂量依赖性，综合考虑药物的安全浓度，分别以、和 作用。处理 后的细胞样本用 检测 的 表达水平。结果（图）显示，随着 浓度的升高，表达水平随之下降，虽然 和 处理效果稍有变化，但整体显示米非司酮对 的抑制效果呈现一定的剂量依赖关系
13、。米非司酮抗 作用发生阶段上述结果表明米非司酮在 细胞中抑制 的复制，为找出米非司酮抗 作用发生的阶段，分别在病毒吸附、入胞和复制阶段用 处理细胞，测定其对病毒增殖抑制作用情况。结果表明，在病毒吸附和入胞阶段均不能阻止病毒进入细胞（图、），但能在病毒复制阶段发挥作用（图、）。米非司酮与氢醌联合用药对 的抑制作用将非司酮和氢醌共同作用细胞后接种病毒，收取样品进行 ，观察药物对病毒复制的影响。结果（图）显示，联合用药（）组 蛋白表达水平明显低于单独用 组。说明米非司酮和氢醌联用对 的抑制效果要优于单独用药。小鼠攻毒保护试验 临床症状和存活情况 在攻毒给药后，每天观察小鼠的临床症状并记录其死亡数。结
14、果（图）显示：攻毒对照组在攻毒后第 天大部分小鼠出现神经症状，表现为搔痒、啃咬背部注射部位、抓挠身体等，并有精神抑郁、离群发呆的症状。其中攻毒对照组在第 天死亡 只（死亡率），第 天死亡 只（死亡率），第 天全部死亡。氢醌（）组推迟到第 天死亡 只（死亡率），第 天死亡 只（死亡率），最后存活 只小鼠。米非司酮（）组第 天死亡 只（死亡率），第 天死亡 只（死亡率），最后存活 只小鼠。联合用药（）组第 天死亡 只，第 天死亡 只，最后存活 只小鼠。空白对照组小鼠全部存活。南 京 农 业 大 学 学 报第 卷图 米非司酮（）抗病毒的作用阶段.（）病毒吸附阶段 ；病毒入胞阶段 ；细胞被感染 后 ；
15、细胞被感染 后 图 米非司酮和氢醌（）协同对 抑制作用.（）检测米非司酮和氢醌联用对 的抑制作用 ；蛋白相对表达水平 图 攻毒保护试验中小鼠的生存曲线.小鼠组织脏器病毒载量 在攻毒 后每组随机剖杀 只小鼠，采集脑和肝脏，检测组织脏器中 的 含量。结果（图）表明：在 时，与其他组比较，联合给药组脑组织和肝脏中的病毒载量明显减少，空白对照组中未检测到病毒。以上结果表明氢醌与米非司酮联合用药能显著抑制小鼠脑和肝脏组织中（）的增殖。小鼠组织脏器病变观察 在攻毒 后，从每组随机选取 只小鼠解剖，观察其脑、肺脏、肝脏的病变。结果（图）显示：攻毒对照组肺有出血充血，脑出现充血，肝无明显变化；联合用药组与米非
16、司酮、氢醌组相比，脑出血、肺出血、充血和肝脏病变轻微。此外，米非司酮组脑部和肺部组织有充血，但充血程度介于氢醌组和攻毒组之间，表明米非司酮具有一定的体内抗病毒效果，但是体内抗病毒效果弱于氢醌。第 期李紫彤，等：米非司酮的抗伪狂犬病毒作用及其与氢醌的协同效应图 各组小鼠脑部和肝脏（攻毒后 ）的病毒载量.图 各组小鼠的组织脏器病变.，讨论伪狂犬病是由伪狂犬病病毒（）感染引起的急性病毒性传染病，严重危害养猪业发展。年 出现变异毒株，该种毒株毒力增强、抗原性明显变异，导致疫苗免疫失败，现有疫苗不能有效保护猪群抵抗变异株感染，活疫苗普遍存在散毒及毒力返强等安全隐患，灭活疫苗免疫原性差，不能诱导细胞毒性 淋巴细胞（）反应，给我国伪狂犬病防控带来新的挑战。因此，面对 的感染情况，探索有效的治疗药物对免疫失败的特殊动物个体具有一定临床应用意义。近年来，人源疱疹病毒（）抗病毒药物取得很大发展，由 年被 批准用于疱疹病毒角膜炎的第一代抗疱疹病毒药物 碘苷发展到现如今的核苷类抗疱疹药物、非核苷类抗疱疹药物、新兴抗疱疹药物、天然抗疱疹药物等许多种类。这些抗疱疹药的研究对抗 药物研发有重要的参考价值。在国内，对