1、技术与方法生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):158-170收稿日期：2022-09-26 基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（41906081），青岛海洋科学与技术试点国家实验室海洋生物学与生物技术功能实验室人才支持计划项目（YJ2019NO02）作者简介：赵金玲，女，硕士研究生，研究方向：线虫遗传发育与转录调控；E-mail:通讯作者：任晓亮，男，博士，副研究员，研究方向：线虫遗传发育与转录调控；E-mail:单细胞转录组测序（single-cell RNA sequencing，scRNA-seq）是以单细胞分辨率对转录组进行扩增与测序的
2、一项技术，可以动态反映细胞的功能和类型，筛查复杂和罕见的细胞群，追踪不同细胞系的发育轨迹1。以往研究表明，单个细胞的基因表达模式即使在遗传上同质的细胞群体内部也具有很大程度的细胞间差异2-3，而传统的转录组测序技术（bulk RNA-seq）难以分辨此类差异，scRNA-seq 则单细胞转录组测序技术及其在秀丽隐杆线虫中的应用赵金玲1，3 安磊1，3 任晓亮1，2（1.中国科学院海洋研究所 海洋生物分类与系统演化实验室，青岛 266071；2.青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋生物学与生物技术功能实验室，青岛 266237；3.中国科学院大学，北京 100049）摘 要：单细胞转录组测序技
3、术使人们摆脱了细胞异质性问题的干扰，从而在单个细胞水平实现对基因表达及转录调控机制的探索，以及对不同细胞亚群和特殊细胞类型的识别，对系统发育领域的研究具有重要意义。传统模式生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）由于体细胞数目固定、细胞分化路径清晰等特点，近年来成为了单细胞转录组学研究的重要模型。本文对目前单细胞转录组测序技术的发展现状进行综述，总结其在秀丽隐杆线虫的细胞谱系分析、单细胞轨迹推断以及神经元细胞图谱等研究工作中的应用情况，并对未来的研究方向作进一步展望。关键词：单细胞转录组测序；秀丽隐杆线虫；细胞谱系DOI:10.13560/ki.biotech.bull
4、.1985.2022-1190Development of Single Cell Transcriptome Sequencing Technology and Its Application in Caenorhabditis elegansZHAO Jin-ling1，3 AN Lei1，3 REN Xiao-liang1，2（1.Laboratory of Marine Organism Taxonomy and Phylogeny,Institute of Oceanology,Chinese Academy of Sciences,Qingdao 266071;2.Laborato
5、ry for Marine Biology and Biotechnology,Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology,Qingdao 266237;3.University of the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049）Abstract:Single cell transcriptome sequencing technology enables people to get rid of the interference of cell heterogenei
6、ty，thus realizing the exploration of gene expression and transcriptional regulation mechanism at single cell level，as well as the recognition of different cell subpopulations and special cell types，which is of great significance to the research in the field of phylogeny.The traditional model organis
7、m Caenorhabditis elegans has become an important model for single-cell transcriptomic research in recent years because of its fixed number of somatic cells and clear trajectory of cell differentiation.This paper summarizes the development of single-cell transcriptome sequencing technology and its ap
8、plication in the research of cell lineage analysis，single-cell trajectory inference and neuronal cell Atlas of C.elegans，and further prospects the future research direction.Keywords:single-cell RNA sequencing；Caenorhabditis elegans；cell lineage2023,39(6)159赵金玲等：单细胞转录组测序技术及其在秀丽隐杆线虫中的应用可以有效解决上述的细胞异质性问
9、题4。2009 年Tang 等5优化了单细胞转录组测序方法，并在小鼠卵裂球和卵母细胞中鉴定了许多以前未知的剪接连接点（splice junctions），首次实现了单细胞水平的转录组测序分析工作。2019 年，Ryu 等6利用scRNA-seq 绘制了拟南芥幼苗根单个原生质体的转录组图谱，提供了单细胞水平的基因表达图谱，证明了这一技术应用于植物研究的可行性。2021 年 Le等7将 scRNA-seq 与 CRISPR 技术结合用于乙型肝炎感染研究，在其他高丰度基因存在的情况下，成功获取了低丰度乃至罕见基因的表达信息。近年来，单细胞空间转录组测序技术8和基于第三代测序平台9的单细胞转录组测序技
10、术获得了快速发展，拓宽了 scRNA-seq 的应用范畴。目前基于单细胞水平的转录组学研究工作已在肿瘤学10、发育生物学11和神经科学12等领域广泛开展，表现出重要的应用价值。秀丽隐杆线虫是第一个拥有完整基因组序列的多细胞生物13，其生命周期短（25条件下从卵发育到成虫仅需 3 d）、体型小（新孵化的幼虫长约 0.25 mm，成虫长约 1 mm）且身体透明，是真核生物遗传学和发育生物学领域的重要模式生物14-15。近年来，随着单细胞转录组测序技术的发展，秀丽隐杆线虫凭借其独特的优势，比如体细胞数量固定、细胞分化谱系清晰等特点，为优化单细胞转录组测序技术的实验操作以及数据分析流程提供了高效的检测
11、模型。基于秀丽隐杆线虫的单细胞转录组学研究工作，一方面促进了该项技术的进一步完善，另一方面加深了人们对多细胞生物的基因动态表达、分子调控机制、生长发育机制以及寿命与衰老等问题的理解。本文将对 scRNA-seq 的发展现状以及其在秀丽隐杆线虫中的应用情况进行介绍，并对未来的研究方向作进一步展望。1 单细胞转录组测序技术概述完整的 scRNA-seq 实验流程包括单细胞分离与捕获、文库构建、高通量测序和数据分析四部分16。常用的单细胞分离与捕获方法包括有限稀释17、免疫磁性细胞分选18、荧光激活细胞分选19（fluorescence-activated cell sorting,FACS）、微流
12、体、显微操作以及激光捕获显微解剖20（laser capture microdissection,LCM）等。细胞数量较少的生物样本可以采用移液微操作或 LCM 的方法分离单细胞，上述方法的单细胞捕获率高、费用低，但费时费力、通量偏低。细胞数量较多的生物样本需要固定组织，制备细胞悬浮液，从而分离与捕获单细胞。制备细胞悬浮液可通过一组特定的酶或机械力或两者结合来对组织进行解离。解离效率一般会受到细胞类型、组织类型和发育阶段的影响，解离过程会导致细胞内源性转录的改变进而影响细胞活力，需要提前测试21。添加转录抑制剂可减少解离导致的转录改变22。单细胞分离和捕获方法因不同生物体、组织或细胞特性而异2
13、3，可以通过分离整个细胞、细胞特异性细胞核、细胞特异性细胞器或表达特异性标记蛋白的细胞等不同策略来完成24。2018 年，Brasko 等25开发了计算机辅助显微镜分离（computer assisted microscopy isolation,CAMI）技术，结合图像分析算法、机器学习和高通量显微镜技术识别单细胞，通过 LCM 或显微操作进行自动无中断收集，提高了通量和准确性。2020 年，Lamanna 等26构建了可用于组学的单细胞数字微流控分离平台（digital microfluidic isolation of single cells for-omics，DISCO），研究人员
14、可借此选择特定细胞，识别单核苷酸水平上的变异，并将单细胞测序数据与其基于免疫荧光的表型相关联，对具有环境依赖性的罕见细胞群的深入分析具有重要的应用价值。文库构建需要提取单细胞中的 mRNA 并反转录为 cDNA，进而扩增测序27。起始 cDNA 往往需要扩增至纳克级才能满足高通量测序建库要求28。目前常用的单细胞转录组扩增方法有 PCR 法和体外转录线性扩增28。利用 PCR 法的 scRNA-seq 技术有Smart-Seq/Smart-Seq229、10Chromium30、Drop-seq31、SCRB-seq32、Seq-Well33以 及 sci-RNA-seq34等。利用体外转录线
15、性扩增的技术有 CEL-seq35、CEL-seq236、inDrops37以及 MARS-seq38等。在文库构建过程中，可以对每个细胞的 mRNA 用细胞条形码或独特的分子标识符（unique molecular identifier，UMIs）39进行标记。分子标识符可用于区分测序所得 reads 是来源于同一 mRNA 分子还是生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6160来自同一基因转录的不同 mRNA 分子的扩增拷贝。但在实际操作过程中，使用细胞条形码与分子标识符标记均可能会出现“假信号”，即出现未标记真正的单细胞或者与多个单细胞配
16、对的情况，混淆下游分析，需要在后期数据分析过程中进行相应的处理来减少上述情况的干扰。为了研究不同单细胞测序技术的适用范围，Ding 等40选取人类和小鼠细胞系的混合物、人外周血单核细胞（PBMCs）及小鼠皮层核（mouse cortex nuclei）3 种样本类型，并开发了通用的 scumi计 算 管 道，对 2 种 低 通 量（Smart-seq2 和 CEL-seq2）和 5 种 高 通 量（10Chromium、Drop-seq、Seq-Well、inDrops 以及 sci-RNA-seq）方法进行了比较。结果显示，在测序灵敏度方面，两种低通量方法 Smart-seq2 和 CEL-Seq2 在检测基因变异和鉴定mRNA 剪接亚型方面表现相似。对于需要较高灵敏度的研究，这两种方法明显优于高通量方法。在测序用时方面，10Chromium 耗时最短，Smart-seq2、CEL-Seq2 和 inDrops 耗时最长。在测序成本方面，Drop-seq、Seq-Well 和 inDrops 成 本 最 低，Smart-seq2 因为在文库制备过程中没有池化成本最高，sci-RNA-