1、研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):208-216收稿日期：2022-11-14基金项目：国家自然科学基金项目（31971990，31901593），2019 年海南省基础与应用基础研究计划（自然科学领域）高层次人才项目（2019RC300），现代农业产业技术体系建设专项资金（CARS-170301）作者简介：赵雪婷，女，硕士研究生，研究方向：作物遗传与品种改良；E-mail:通讯作者：李富生，男，博士，教授，研究方向：甘蔗资源创新与利用；E-mail:；张树珍，女，博士，研究员，研究方向：甘蔗生物技术；E-mail:甘蔗 AP2/ERF 转录
2、因子基因 ShERF3 的克隆、表达及其编码蛋白的定位赵雪婷1 高利燕2 王俊刚2 沈庆庆1 张树珍2 李富生1（1.云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201；2.中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口 571101）摘 要：AP2/ERF 转录因子在调控植物的生长发育、抵抗生物和非生物胁迫方面发挥重要作用。克隆 ShERF3，并分析其功能，为甘蔗抗逆遗传改良提供基因资源。基于转录组数据从 新台糖 22 号 甘蔗中克隆 ShERF3，并通过 Real time PCR、生物信息学分析、水稻原生质体亚细胞定位等技术对 ShERF3 编码的蛋白特性、亚细胞定位及基因表达模式进行分析。
3、结果显示，克隆获得 1 142 bp ShERF3 的 cDNA 序列，包含 1 个 1 053 bp 的完整开放阅读框，编码 350 个氨基酸；ShERF3 蛋白含有一个 AP2 结构域，属于 AP2/ERF 家族 ERF 亚家族成员，与高粱和柳枝稷 ERF3、谷子和哈氏黍 ERF118 蛋白同源性较高；ShERF3 蛋白是一种不稳定的疏水性蛋白，亚细胞定位结果显示其定位于细胞核；ShERF3 主要在甘蔗成熟茎节中表达，在叶片和根系中相对表达较低；在 PEG 处理下，ShERF3 表达先下调后上调，在 NaCl 处理下，随着胁迫时间延长 ShERF3 表达量降低。甘蔗 ShERF3 积极响应
4、干旱和盐逆境胁迫，可能在甘蔗茎秆发育、干旱以及盐胁迫应答方面发挥关键作用。关键词：甘蔗；ShERF3；非生物胁迫；表达分析；亚细胞定位 DOI：10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1400Cloning and Expression of AP2/ERF Transcription Factor Gene ShERF3 in Sugarcane and Subcellular Localization of Its Encoded Protein ZHAO Xue-ting1 GAO Li-yan2 WANG Jun-gang2 SHEN Qing-qing1
5、 ZHANG Shu-zhen2 LI Fu-sheng1（1.College of Agronomy and Biotechnology,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201;2.Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology,Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences,Haikou 571101）Abstract:AP2/ERF transcription factors play an important role on re
6、gulating plant growth and development and involving in biotic and abiotic stresses resistances in plants.Cloning and gene function analysis of ShERF3 may provide gene resource for sugarcane resistance genetic improvement.The ShERF3 gene was cloned fromROC22sugarcane plants based on the transcriptome
7、 data.Then the structure,subcellular location and gene expression pattern of ShERF3 were analyzed with real time PCR,bioinformation and rice protoplast subcellular location methods.The results showed that 1 142 bp cDNA sequence of ShERF3 was obtained.It contained a 1 053 bp integral opening reading
8、frame encoding 350 amino acids.The predicted encoding protein of ShERF3 containing a conserved AP2 domain belonged to the ERF subgroup of AP2/ERF family.The homology analysis indicated that ShERF3 was highly homologous with ERF3 from Sorghum bicolor and Panicum virgatum and ERF118 from Panicum halli
9、i and Setaria italica.It predicted that ShERF3 is a unstable hydrophobic protein.The subcellular location analysis showed that ShERF3 located in the nulear of rice protoplast cells.ShERF3 mainly expressed in sugarcane mature internodes 2023,39(6)209赵雪婷等：甘蔗 AP2/ERF 转录因子基因 ShERF3 的克隆、表达及其编码蛋白的定位甘蔗（Sac
10、charum spp.）是世界以及我国最为重要的糖料作物，同时也是一种理想的能源作物。干旱、高盐等非生物胁迫很大程度上制约着甘蔗的品质和产量1-2，优良抗逆甘蔗品种的培育有助于甘蔗增产稳产。由于甘蔗基因组复杂，表型与环境的互作效应大3，且甘蔗抗逆候选基因挖掘不足4等原因，甘蔗分子生物学研究进展缓慢。因此深入认识甘蔗抗逆分子机制、挖掘甘蔗抗逆候选基因显得尤为重要。AP2/ERF（APETALA2/ethylene-responsive factor）转录因子是植物中最大的转录因子家族之一，在植物的生长发育、生物和非生物逆境响应中起着重要作用，其特征是含有保守的大小为 57-66 个氨基酸的 AP
11、2/ERF DNA 结合域5。AP2/ERF 基因构成了一个庞大的多基因家族，根据其序列相似性和AP2/ERF 结构域的数量，分为 AP2、CBF/DREB、ERF 和 RAV 四个亚家族6。AP2 亚家族蛋白包含2 个 AP2/ERF 结构域，该亚家族中的基因参与植物发育过程的调控7。RAV 亚家族蛋白包含一个AP2/ERF 结构域和一个 B3 结构域，其生物学功能不同，参与不同类型的转录过程，也有报道称 RAV亚家族成员参与乙烯反应8、油菜素类固醇反应9以及生物和非生物应答反应10。与 AP2 和 RAV 亚家族成员不同，CBF/DREB 和 ERF 亚家族蛋白包含单个 AP2/ERF 结
12、构域。CBF/DREB 亚家族中的基因通过识别以 A/GCCGAC 为核心基序的脱水响应元件或 DRE/CRT 作用元件（dehydration-responsive element/C-repeat，核心序列为 CCGAC），在植物对非生物胁迫的抗性中发挥关键作用11。ERF 亚家族主要通过识别顺式作用元件 GCC box（核心序列为GCCGCC）参与对胁迫的反应，一些 ERF 亚家族成员也结合 DRE/CRT 作用元件12-14。在拟南芥15（Arabidopsis thaliana）中已发现147 个 AP2/ERF 成 员，水 稻15（Oryza sativa）中有 164 个 AP2
13、/ERF 成员，在玉米 B73 基因组中鉴定出 214 个 AP2/ERF 基因家族成员16，甘蔗野生种割手密（Saccharum spontaneum）基因组中挖掘获得121 条 SsAP2/ERF 基因3。乙烯响应因子（ethylene response factors，ERFs）是乙烯转导途径的最下游调控因子17-19，已有各种研究表明，ERF 蛋白可以作为乙烯信号传导和胁迫响应基因调控节点20，在对非生物胁迫（如高盐、干旱和低温条件）的反应中起重要作用21。烟草中过表达番茄 SlERF.C1 能够激活 ABA、干旱和盐胁迫相关的基因22。过表达SlERF.E2 转基因烟草通过 SlER
14、F.E2 结合 DRE/CRT和 GCC 顺式元件来调节胁迫基因的表达，从而增强植株对高盐浓度和渗透性胁迫的耐受性23-24。过表达 AtERF7 基因使拟南芥植株的保卫细胞对 ABA敏感性增加，导致叶片蒸腾作用加快，从而使植株抗旱性降低25。水稻 OsERF71 通过调节 ABA 响应基因和脯氨酸合成基因的表达从而增强植物的抗旱性26。而大豆（Glycine max）GmERF71 可以响应ABA 信号，促进根毛的快速生长，在一定程度上提高转基因大豆的抗旱性27。干扰 StERF3 在马铃薯（Solanum tuberosum）中的表达，导致马铃薯耐盐性增强，而过表达 StERF3 的转基因
15、马铃薯植株耐盐性降低，证实 StERF3 在马铃薯盐胁迫反应中起负调控作用28。在正常生长条件下，植物体内乙烯的含量都能够保持在比较平稳的水平，而当植物受到非生物胁迫时，植物体内乙烯的含量会发生变化，胁迫刺激后产生的乙烯通过其信号转导途径进行传递，能够对下游的胁迫相关基因进行调控，进而应答逆境胁迫29。关于甘蔗乙烯应答转录因子 ERFs 的研究很少，陈玉凤等3前期利用生物信息学方法从甘蔗野生种割手密基因组挖掘获得 121 条 SsAP2/ERF 基因序列，对其进行聚类分析，但对其在非生物胁迫等方面的具体功能鲜见报道。本研究基于前期课题组的转录组数据，从新and relatively lower
16、 expressed in the leaves and roots.In addition,the expression of ShERF3 was firstly down-regulated and then up-regulated under PEG treatment.And the expression of ShERF3 decreased with the extension of stress time under NaCl treatment.These results indicates that ShERF3 actively responds to draught and salt stresses.It may play a key role on regulating sugarcane stem development,draught and salt stresses responses.Keywords:sugarcane;ShERF3;abiotic stress;expression analysis;subcellular localizat