1、临床论著膜联蛋白 与胶质母细胞瘤患者预后的相关性研究马凯明 陈素华 陈 新 刘维海 赵晓芳 杨辰龙 杨 军（北京大学第三医院神经外科，北京）【摘要】目的 探讨胶质母细胞瘤（，）中膜联蛋白（，）表达与患者预后的关系。方法 纳入癌症基因组图谱（，）中临床资料完整的 例 进行病例 对照研究。自变量为 转录水平等临床因素，因变量为患者总生存期（，）。依据 长短将入组患者分为病例组（个月）及对照组（个月）。通过限制性立方样条分析（，）、单因素和多因素 回归分析 肿瘤组织中 转录水平与患者临床预后的关系。结果单因素分析显示 表达量（，）、年龄（，）、分子分型（，）及 甲基鸟嘌呤 甲基转移酶（，）启动子状态
2、（，）与 患者预后相关。进一步 分析显示 患者不良预后发生风险随 转录水平升高而增加。多因素 回归分析显示在年龄、启动子甲基化类型、分子分型综合作用下，转录水平与患者不良预后之间存在独立的“剂量 反应”关系（，）。结论 肿瘤组织中 转录水平与患者不良预后风险存在独立的“剂量 反应”关系，是 患者的独立预后因素。【关键词】膜联蛋白；胶质母细胞瘤；预后；分子标志物文献标识：文章编号：（）：，：，：【】（）（）（），（），（）（）（），（，），（，），（）（，）（，），（，.），中国微创外科杂志 年 月第 卷第 期 ，基金项目：国家自然科学基金（，）；北京大学临床科学家计划（）；北京大学第三医院临床
3、重点项目（）通讯作者，：【】；胶质母细胞瘤（，）作为成人中枢神经系统（，）侵袭性最强的原发性恶性肿瘤，约占 胶质瘤总体发病率的 。现有治疗方案包括手术切除、化学药物治疗、放射治疗及分子靶向治疗，。近年来兴起的免疫治疗在改善 整体预后方面未取得理想进展，主要归因于 的高度免疫抑制肿瘤微环境（，），。富集更多免疫抑制相关分子标志物的集束化靶向治疗策略有望突破 免疫治疗的困境，。本课题组前期研究显示膜联蛋白（，）在胶质瘤中高表达且与抑制性免疫细胞浸润显著相关，且体外实验证实靶向阻断 表达可抑制 细胞恶性表型，但是目前大多数研究集中于体外细胞系水平研究 对胶质瘤细胞生物学行为的影响，组织层面对 与 预
4、后之间的关系尚缺乏临床研究证实，一定程度上限制基于 的 诊疗策略进展。本研究分析癌症基因组图谱（，）数据库中 例 肿瘤组织 转录水平与患者预后之间的关系，旨在从临床角度拓展对 中临床意义的客观认识，为临床上筛选更多与 预后相关的分子和后续设计以 为潜在靶点的 精准诊疗策略提供新的思路和理论依据。对象与方法 研究对象本研究由北京大学第三医院医学科学研究伦理委员会审批（）医伦审第（）号，公共数据库来源数据由伦理委员会豁免书面知情同意书签字。从 数据库（：）下载共 例胶质瘤的临床资料及匹配的 转录组测序（，）数据，下载时间为 年 月 日。从中筛选出术后病理诊断为 例，按照纳入、排除标准删除 例，最后
5、纳入 例 进行回顾性病例 对照研究。男 例，女 例。年龄（）岁（岁）。纳入标准：术后病理证实为；存在相匹配的肿瘤组织中 表达的 级（标准化）数据；患者基本数据、病理分级、分子病理学和生存信息齐全无缺失。排除标准：除原发性 以外病理学诊断为任何其他脑肿瘤类型的患者；复发性；取得病理组织学诊断前有放疗或化疗史；的 数据不完整；失访及临床资料存在缺失。分组标准：以总生存期（，）是否超过 个月为依据将患者分为病例组（个月，）和对照组（个月，）。方法收集患者性别、诊断时年龄、预后、术后病理病 理 类 型 及 异 柠 檬 酸 脱 氢 酶（，）类型、染色体共缺失类型、甲 基 鸟 嘌 呤 甲 基 转 移 酶（
6、，）启动子甲基化状态等以及肿瘤 分子分型。预后的观察指标为，定义为从初次手术日期到死亡或最后一次随访的持续时间，患者最后一次随访存活被认为生存。年龄以 诊断中位年龄 岁作为分界。同时 收 集 入 组 患 者 相 匹 配 肿 瘤 组 织 中 的 定量数据，将其标准化为每百万转录本（，）后进行对数转换（），依据转换后 表达量的中位数（）将 转录水平分为高表达和低表达。上述信息均由 名独立调查员下载、提取、预处理和审查，另外 名经验丰富的调查员独立检查和分析上述信息。临床资料遵循盲法原则。统计学处理采用 和 软件 版本 （：）对数据进行统计学分析及图形可视化。以 为因变量，采用 回归分析评估 等自变
7、量的优势比（，）和。通 过 限 制 性 立 方 样 条（，）分析评估 转录水平与 患者不良预后风险之间的关系。赤池信息量准则（，）用于评估多因素 回归分析模型拟合的优良性，全局变量采用对数秩检中国微创外科杂志 年 月第 卷第 期 ，验。双侧检验，差异有统计学意义。结果 患者临床基线资料分析单因素分析显示 表达量（，）、年龄（，）、分子分型（，）及 启动子甲基化类型（，）与 患者预后相关，见表。表 病例组与对照组预后的单因素分析变量病例组（）对照组（）值值 值性别 男 女年龄（岁）状态 野生型 突变型 染色体状态 非共缺失型 共缺失型 启动子状态 非甲基化型 甲基化型 分子分型 非间充质型 间充
8、质型 表达量 高表达 低表达 ：异柠檬酸脱氢酶；：甲基鸟嘌呤 甲基转移酶；：癌症基因组图谱；：膜联蛋白 肿瘤组织中 转录水平对患者预后的影响 分析 相对值和 患者不良预后之间的关系为探究 患者不良预后发生风险随 表达变化的情况，以 表达量（）为自变量，患者预后情况为因变量绘制 曲线模拟二者的“剂量 反应关系”，结果显示随着 表达量升高，患者不良预后发生风险增加，见图。影响 患者预后的多因素 回归分析 为评估 相对值与患者预后之间上述“剂量 反应”关系的独立性，进一步将单因素分析中 的变量纳入多因素 回归分析，结果显示在年龄、启动子甲基化类型、分子分型及 表达的综合作用下，图 评估 表达量（）与
9、 患者不良预后的关系（实心黑线为“剂量 反应”曲线，曲线上下黑色范围为，为优势比；：胶质母细胞瘤，：膜联蛋白，：每百万转录本）中国微创外科杂志 年 月第 卷第 期 ，表达量与 患者不良预后发生风险之间具有独立的“剂量 反应关系”（.，），见表。表 患者预后的多因素 回归分析变量回归系数 值 值 值年龄 岁 启动子非甲基化 间充质型 高表达 常数项 ：甲基鸟嘌呤 甲基转移酶；：癌症基因组图谱；：膜联蛋白。赤池信息量准则（）讨论近年来，的免疫治疗成为脑胶质瘤研究热点，由于 本身具有较大异质性，及细胞内部存在极其复杂的分子调控网络，许多研究报道的免疫治疗方法在初步临床试验中并未取得理想效果。近期研究
10、，认为整合更多与 抑制性 特征密切联系的生物标志物集束方案在克服现有治疗困境方面具有可观的应用前景。本研究探索性分析 例 的临床资料，通过 与 生存预后的相关性研究，初步证实 是与 患者临床预后相关的分子，转录水平与患者不良预后风险之间存在独立的“剂量 反应”关系，可作为 患者的独立预后因素。为后续深入研究 在 中的作用提供新的依据。作为膜联蛋白家族的重要成员，在体内以单体、异二聚体或异四聚体的形式存在，其中单体形式位于细胞质、细胞核和早期的核内体上，而异四聚体位于细胞膜上，由 个 单体和 个 组成，。其生理功能包括物质囊泡转运、细胞分裂、钙信号传递、纤溶过程和细胞生长等。研究证实 可促进肿瘤
11、细胞增殖、迁移、上皮间质转化（，）、肿瘤干细胞（，）形成及治疗抵抗，已在乳腺癌、结直肠癌和肺癌等恶性肿瘤中均被证实是与肿瘤侵袭相关的分子标志物，而且参与肝癌和鼻咽癌等肿瘤的免疫抑制过程。在肿瘤诊断学研究方面，被证实可作为血清标志物用于肺癌及肝癌的早期诊断，同时可用来监测卵巢癌和乳腺癌的 过程。随胶质瘤的肿瘤级别升高而表达增加，其在 肿瘤组织中表达显著高于周围正常脑组织。与信号转导和转录激活因子（，）结合后被证实引起磷酸化 水平变化，进而和 细胞周期蛋白（）信号通路相互作用促进胶质瘤细胞增殖。还被证明通过 上调下游 的表达，通过 正反馈环路促进胶质瘤细胞以 依赖 的 方 式 进 行 增 殖。环路
12、也被证明为维持 生长和侵袭的基础机制之一。正反馈环路被证实在 中促进肿瘤细胞生长、迁移、侵袭、过程及 生成。还可作为纤溶酶原受体促进纤溶酶原激活及纤溶酶转化，同时激活金属蛋白酶引发细胞外蛋白水解级联反应，显著降解 及纤维连接蛋白，促进胶质瘤细胞侵袭，。最 近 本 课 题 组 研 究 报 道 胶 质 瘤 中 高表达会上调胶质瘤 中肿瘤相关巨噬细胞、调节性 淋巴细胞和髓源性抑制细胞的浸润水平，密切参与胶质瘤相关炎症活动、多种免疫细胞浸润和免疫抑制等过程。这些前期报道从基础研究角度说明了 在 多种恶性生物学行为中的作用，提示 高表达的 患者可能存在更差的临床预后，但是缺乏临床研究层面的验证。为验证上
13、述推论，本研究围绕 患者肿瘤组织中 表达对患者预后的影响展开 相关性关系及单因素和多因素 回归分析，结果显中国微创外科杂志 年 月第 卷第 期 ，示 肿瘤组织中 转录水平与患者不良预后存在独立的“剂量 反应”关系，是 患者的独立预后因素，初步揭示了 在 预后评估方面的临床意义，提示我们可以进一步深入探索以 为潜在靶点的 靶向治疗可能性。既往研究显示在小鼠 细胞系 中敲减 基因表达可减少肿瘤细胞体外迁移，抑制肿瘤体内生长、侵袭、增殖、血管生成以及促进肿瘤细胞死亡。同样在犬 细胞系、人胶质瘤细胞系（、）、患者来源的胶质瘤原代细胞，以及 干细胞样肿瘤细胞，中证实体外敲除 能够显著抑制其增殖和侵袭等
14、恶 性 表 型。使 用 特 异 性 单 克 隆 抗 体 阻 断 作用后能明显抑制患者来源 原代细胞的迁移、侵袭和增殖，过表达 会显著促进 细胞系和原代 细胞的增殖和侵袭。针对 的抗体或小分子抑制剂还有利于改善胶质瘤的免疫抑制过程。特异性阻断 四聚体与组织蛋白酶 之间的相互作用被证实显著减少胶质瘤侵袭引起的 降解和血脑屏障破坏，减轻肿瘤周围水肿的同时消除了利于肿瘤向外侵袭的营养生态位，。因此，结合上述前期报道及本研究结果，有望成为改善 临床预后可能的治疗靶点。本研究也同时证实年龄、启动子甲基化类型、分子分型同样是 患者的预后相关因素，与既往研究一致，也间接说明本研究数据来源的可靠性。鉴于 数据库
15、中 数据为多细胞水平测序的结果，且该公共数据库中部分患者治疗详情记录存在一定局限性，目前我们正同步进行单中心队列研究结合单细胞测序工作以进一步优化目前研究。未来也需要在进一步扩大研究样本量的同时开展多中心队列研究，同时对 在 中的具体作用进行更为深入的机制研究及临床前研究。综上所述，鉴于目前临床上存在的 免疫治疗困境，本研究在前期对胶质瘤免疫微环境研究基础上，通过对筛选出的 免疫抑制相关分子 与 患者的临床预后相关性进行探索性研究，结果显示 肿瘤组织中 转录水平与患者不良预后之间存在独立的“剂量 反应”关系，可作为 患者的独立预后因素。本研究结果从临床研究角度为进一步研究 在 中的作用及临床应
16、用提供新的证据，对未来集束化靶向治疗改善 的治疗反应性有一定参考意义。参考文献 ，：，（）：，：，（）：，（）：，（）：孙建军，陈素华，尹晓亮，等 侧方非功能区入路切除功能区脑胶质瘤 中国微创外科杂志，（）：，：马凯明，陈新，杨军 在成人弥漫性胶质瘤中的作用及其机制研究进展 中华神经外科杂志，（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：（）：，（）：，（）：中国微创外科杂志 年 月第 卷第 期 ，（），（）：，（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：马凯明，杨 军 脑胶质瘤瘤周水肿区细胞外间隙改变及机制研究进展 中华神经医学杂志，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：（收稿日期：）（修回日期：）（责任编辑：李贺琼）中国微创外科杂志 年 月第 卷第 期 ，