1、研究报告生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2023,39(6):316-324收稿日期：2022-10-11基金项目：河北省科学院高层次人才培养与资助项目（2021G27,2022G16）作者简介：董聪，女，硕士，助理研究员，研究方向：酶制剂；E-mail:；董聪同时为本文通讯作者FAD 依 赖 的 葡 萄 糖 脱 氢 酶（FAD-GDH）（EC1.1.99.10）是一类以 FAD 为辅基催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸内酯的氧化还原酶，广泛应用于血糖检测、生物燃料电池1、植入式心脏起搏器2和基于联合策略提高 FAD 依赖的葡萄糖脱氢酶的酵母 表达董聪 高庆华 王玥 罗同阳 王
2、庆庆（河北省微生物研究所有限公司，保定 071051）摘 要：为了提高了 FAD 依赖的葡萄糖脱氢酶在毕赤酵母中的表达量，本研究通过 G418 浓度梯度筛选，构建含有不同分子伴侣基因拷贝数共表达毕赤酵母重组菌株实现高效表达，优化摇瓶发酵条件。经 G418 浓度梯度筛选，得到 1 株高产重组菌，在此基础上分别构建了 HAC1、Ero1、PDI 三种分子伴侣 1-4 拷贝共表达重组菌株，RT-qPCR 检测结果符合预期。试管水平酶活表明 3 拷贝 PDI、3 拷贝 HAC1 和 2 拷贝 Ero1 分别比 1 拷贝提高 83%、77%和 51%。总体比较而言，共表达 3 拷贝 PDI 的重组菌株酶
3、活最高，比对照提高 198%，优化摇瓶发酵条件表明培养基初始 pH 7.0，摇瓶装液量 50 mL，甲醇添加量 1%，诱导温度 28时，效果最佳。通过抗生素浓度筛选、增加分子伴侣的基因拷贝数策略可以提高 FAD-GDH 在毕赤酵母中的发酵产量。关键词：FAD 依赖的葡萄糖脱氢酶；毕赤酵母；抗生素梯度筛选；分子伴侣多拷贝；发酵条件DOI:10.13560/ki.biotech.bull.1985.2022-1255Increasing the Expression of FAD-dependent Glucose Dehydrogenase by Recombinant Pichia pasto
4、ris Using a Combined StrategyDONG Cong GAO Qing-hua WANG Yue LUO Tong-yang WANG Qing-qing（Hebei Research Institute of Microbiology Co.,Ltd.,Baoding 071051）Abstract:In order to increase the expression of FAD-dependent glucose dehydrogenase（FAD-GDH）in Pichia pastoris,the recombinant strains of co-expr
5、essing different copy numbers of molecular chaperone genes were constructed to achieve high-efficiency expression through the G418 concentration gradient screening,and the shake flask fermentation conditions were optimized.One high-yielding recombinant strain was obtained by G418 concentration gradi
6、ent screening.On this basis,the recombinant strains co-expressing 1-4 copies of three molecular chaperones,HAC1,Ero1 and PDI,were constructed respectively,and the results of RT-qPCR were in line with expectations.The enzyme activity at the test tube level showed that 3 copies of PDI,3 copies of HAC1
7、 and 2 copies of Ero1 increased by 83%,77%and 51%,respectively,compared with 1 copy.The recombinant strain with 3 copies of PDI had the highest enzyme activity,which was 198%higher than the control.The optimal conditions of the recombinant strain were as follows:initial pH 7.0,liquid loading volume
8、50 mL,the methanol addition amount 1%,and induction temperature 28.The efficient expression of FAD-GDH in P.pastoris is achieved by screening of antibiotic concentration and increasing the gene copy number of molecular chaperones.Keywords:FAD-dependent glucose dehydrogenase;Pichia pastoris;antibioti
9、c gradient screening;multiple copies of molecular chaperones;fermentation conditions2023,39(6)317董聪等：基于联合策略提高 FAD 依赖的葡萄糖脱氢酶的酵母表达工业葡萄糖含量监测等领域，特别是在血糖检测方面，由于 FAD-GDH 不利用氧作为电子受体，故不受血液氧分压影响3，适用于检测包括静脉血、动脉血、高海拔等氧气含量不同的样本4。因此具有广泛的应用前景。然而目前 FAD 依赖的葡萄糖脱氢酶主要依赖进口，成本较高，使其在实际生产应用中受到一定制约。利用毕赤酵母表达系统提高 FAD-GDH 产量在其
10、工业化生产中具有十分重要的意义。FAD-GDH 在毕赤酵母表达系统中有过实现可溶表达的报道5-6。毕赤酵母表达系统重组蛋白产量的优化方法有很多种，其中研究最为广泛的是提高插入基因的拷贝数从而提高转录和翻译的水平7。这里的基因拷贝数可以是目的蛋白基因，也可以是辅助蛋白折叠、分泌的分子伴侣基因的拷贝数。通过单交换方式将目的基因插入毕赤酵母基因组，通过两种方法可以筛选获得高拷贝菌株，一是转化后设置不同的抗生素浓度梯度，二是在体外构建多表达盒后转化8-9。HAC1 是转录调控因子，编码 Hac1p 蛋白，可以促进参与 UPR 反应的蛋白编码基因的转录水平，如二硫键异构酶 Pdi1，内质网氧化还原蛋白
11、Ero1p等，共表达后可能从全局改善目的蛋白的折叠与运输10；PDI 与二硫键有关，共表达后可能改善蛋白质的折叠和运输11；Ero1 在内质网中将还原态的PDI 变成氧化态，间接帮助蛋白分泌12。三者分别共表达能提高重组菌株产量的报道有很多13-14。钱晓芬等15通过 PTVA 法获得 HAC1 拷贝数为 3 的重组菌株，使牛乳铁蛋白功能片段产量相比没有共表达 HAC1 时提高 150%，但更高的 HAC1 基因拷贝数会降低重组蛋白产量。Huang 等16通过不同 Zeocin抗生素浓度筛选，结果发现不同 HAC1 基因拷贝数对产量影响不同，过表达 6 拷贝 HAC1 的重组菌株产量提高了 6
12、.2 倍。Inan 等17通过抗生素浓度筛选获得 4 拷贝 PDI 共表达重组菌株，提高了 Na-ASP1的产量。近年来，有很多通过同尾酶法构建基因多拷贝表达盒载体提高外源基因在毕赤酵母中表达量的报道。表达盒是独立的顺式作用元件，多个表达盒可以同向连接在同一载体中，转化宿主后实现多个基因的共表达18。所以，本研究尝试通过抗生素浓度梯度筛选、利用同尾酶法构建含不同分子伴侣拷贝数载体共表达、发酵条件优化进一步提高 FAD-GDH 酶活。1 材料与方法1.1 材料1.1.1 菌株、质粒和试剂 大肠埃希菌（Escherichia coli）TOP10 购自天根生化科技有限公司（北京）；酵母表达菌株、P
13、ichia pastoris X33 由中科院微生物研究所提供；质粒 pMD-GDH19、pPICZB-HAC1、pPICZ-26S-PDI、pPICZ-26S-Ero1 由 本 实 验 室 前 期构建。Q5 DNA 聚合酶、限制性内切酶（EcoR I、Not I、BamH I、Bgl II、Dpn I）、虾碱性磷酸酶 rSAP 和T4 DNA 连接酶等购自 NEB 公司；DNA 分子量标准购自康为生物科技公司；质粒提取试剂盒购自全式金生物科技公司；酵母基因组 DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司（北京）；RT-qPCR 试剂 SimpleChIP Uniwersal qP
14、CR Master Mix 购自北京百灵克生物科技有限公司；G418 购自Invitorgen 公司；博来霉素 Zeocin 购自索莱宝生物科技有限公司；YNB（分子级）购自酷来搏生物科技有限公司；生物素购自博奥拓达生物有限公司；DCIP（2,6-二氯靛酚钠）购自 BBL Life Sciences。本文中所用引物均由通用生物（安徽）股份有限公司合成。1.1.2 培养基 LB 培养基（g/L）：胰蛋白胨 10.0，酵母提取物 5.0，氯化钠 10.0，121灭菌 20 min。YPD 培养基（g/L）：胰蛋白胨 10.0，酵母提取物 5.0，葡萄糖 10.0，固体添加 1.5%-2%（W/V）
15、琼脂，121灭菌 20 min。YPCS 发酵培养基（g/L）：胰蛋白胨 20.0、酵母提取物 10.0，酪蛋白水解物 5.0，山梨醇 5.0，121灭菌 20 min。BMMY 培养基（g/L）：胰蛋白酶 20.0，酵母提取物 10.0，磷酸氢二钾 3.0，磷酸二氢钾 11.8，加水至 895 mL，121灭菌 20 min，温度下降 60生物技术通报 Biotechnology Bulletin2023,Vol.39,No.6318之后，超净台加入 10 mL 过滤除菌 10YNB（13.4 g/L），1 mL 过滤除菌 500 生物素（410-4 g/L），甲醇 5 mL。1.2 方法1
16、.2.1 分子伴侣多拷贝表达载体的构建 首先采用重叠延伸 PCR 将 HAC1、Ero1 和 PDI 基因序列中的Bgl II 和 BamH I 位点在不影响翻译后蛋白序列的条件下定点突变，去除各基因中的 Bgl II 和 BamH I 位点，重叠延伸 PCR 引物见表 1。表 1 突变引物序列Table 1 Mutation primer sequences引物名称Primer name基因Gene引物序列Primer sequence（5-3）H-FHAC1CTCGCAGATCCTTGACTGAGGATCTGGACGAAGH-RCCTCAGTCAAGGATCTGCGAGTGGATGTAGATGE-FEro1TGGAGAAACAAATCTTTTACCGATTGGTTTCTGE-RGGTAAAAGATTTGTTTCTCCAAACAGAGGTCTTCP1-FPDICTGCTGCCGAAATCTTAAAGGACAATGAGCAGGP1-RCCTTTAAGATTTCGGCAGCAGAAACAAGTTCAGP2-FTTGACGGATCTACCTTCAAATCATATGCTGAAGP2-FATT