1、现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 290 基于多重连接依赖探针扩增（MLPA）技术检测 加工食品中过敏原成分 刘艳，王鸣秋，李诗瑶，张涛，何名扬，朱必婷，林津，徐芬，张莉*（湖北省食品质量安全监督检验研究院，国家市场监管重点实验室（动物源性食品中重点化学危害物检测技术），湖北省食品质量安全检测工程技术研究中心，湖北武汉 430075）摘要：该研究基于多重连接探针扩增技术（Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification，MLPA）同时检测开心果、巴西坚果、芹菜、麸
2、质、夏威夷果、芝麻、榛子、大豆、花生、葵花籽、核桃、腰果、杏仁、芥末等14 种植物源性的过敏原成分，针对 ITS序列设计特异性杂交探针，样本核酸经 95 变性后，与探针进行特异性结合，经连接和 PCR 扩增反应得到不同大小的目标片段，通过毛细管电泳分析目标片段的有无来判断是否含有待测过敏原成分。利用混合探针体系检测单一模板只能扩增出单一扩增峰，表明探针具有高特异性，检测限结果表明，MLPA 扩增最低可检出的DNA 质量浓度为1 ng/L。通过 20 份实际样本的检测，证明该研究基于MLPA 建立的加工食品中过敏原成分的检测方法，具有特异性强，灵敏度高的特点，可以应用于食品安全监管工作。关键词：
3、多重连接探针扩增技术；过敏原；特异性；灵敏度 文章编号：1673-9078(2023)06-290-297 DOI:10.13982/j.mfst.1673-9078.2023.6.0637 Detection of the Allergens in Processed Foods Based on Multiple Ligation-dependent Probe Amplification(MLPA)LIU Yan,WANG Mingqiu,LI Shiyao,ZHANG Tao,HE Mingyang,ZHU Biting,LIN Jin,XU Fen,ZHANG Li*(Hubei P
4、rovincial Institute for Food Supervision and Test,Key Laboratory of Detection Technology of Focus Chemical Hazards in Animal-derived Food for State Market Regulation,Hubei Provincial Engineering and Technology Research Center for Food Quality and Safety Test,Wuhan 430075,China)Abstract:In this study
5、,multiplex ligation-dependent probe amplification(MLPA)was applied to simultaneously detect 14 plant-derived allergens from pistachio,Brazil nut,celery,gluten,macadamia nut,sesame,hazelnut,soybean,peanut,sunflower seed,walnut,cashew,almond and mustard.Specific hybridization probes were designed for
6、ITS sequences.After the sample nucleic acid was denatured at 95,specific binding was carried out with the probes,and target fragments of different sizes were obtained through ligation and PCR amplification reaction.The target fragments were analyzed by capillary electrophoresis to determine whether
7、or not the allergens were present.Using the mixed probe system to detect a single template canonly amplifya single amplification peak,indicating that the probe had high specificity.The detection limit results showed that the lowest detectable DNA concentration of MLPA amplification was 1 ng/L.Throug
8、h the detection of 20 actual samples,it is proven that the detection method of allergens in processed foods established in this study on the basis of MLPA has the characteristics of high specificity and high sensitivity,and can be applied to food safety supervision.Key words:multiplex ligation-depen
9、dent probe amplification(MLPA);allergen;specificity;sensitivity 引文格式：刘艳,王鸣秋,李诗瑶,等.基于多重连接依赖探针扩增（MLPA）技术检测加工食品中过敏原成分J.现代食品科技,2023,39(6):290-297.LIU Yan,WANG Mingqiu,LI Shiyao,et al.Detection of the allergens in processed foods based on multiple ligation-dependent probe amplification(MLPA)J.Modern Food
10、 Science and Technology,2023,39(6):290-297.收稿日期：2022-05-19 基金项目：湖北省重点研发计划项目（2020BCA091）；国家市场监督管理总局科技计划项目（2020MK067）作者简介：刘艳（1985-），女，硕士研究生，高级工程师，研究方向：食品安全检测，E-mail： 通讯作者：张莉（1978-），女，硕士研究生，正高级工程师，研究方向：食品质量与安全管理，E-mail： 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2023,Vol.39,No.6 291 过敏属于炎症反应，是指当一些外来物侵入人
11、体时，人体的免疫系统产生的过度免疫反应1,2。过敏性 疾病的发病率在全球处于逐年上升的趋势，数据统计发现，全世界每年食物过敏的患者有 35 亿3，食物过敏问题越来越受到民众的重视，成为食品安全领域的突出问题。过敏症患者摄入过敏原可引发红肿、荨麻疹、瘙痒、水肿、鼻炎、呕吐、腹痛腹泻等多种免疫反应，病情严重的，可因支气管痉挛、窒息或过敏性休克而死亡4。临床上过敏性疾病治疗方法多样，但针对过敏原对症治疗仍是关键，找到过敏原，尽量避免接触过敏原，是预防引起过敏反应发生的主要措施。我国对于食品过敏原标签标识的研究相较于欧美国家起步较晚，2008 年北京市出台的地方标准 DB 11/Z 521-2008奥
12、运会食品安全 食品过敏原标识标注是我国最早的针对食品过敏原标识的法规，并且在奥运会结束后废止。在 2011 年 4 月颁布的国家标准GB 7718-2011预包装食品标签通则中，首次提出了过敏原标注要求，规定食品及其制品若可能导致过敏反应，无论是用作配料还是在加工过程中直接带入这些食品及其制品，都需要进行标注5。其后市场上流通的食品包装大都标注了致敏原信息，但由于加工生产线存在交叉情况，由生产过程带入过敏原的情况非常普遍，然而有时微量摄入也可引起致敏反应6。过敏原标识是否规范需要通过对产品是否含有过敏原进行检测，我国对于食品过敏原的检测标准的制定方面尚处于起步阶段，现有的检测方法主要分为基于蛋
13、白质水平的检测和基于核酸水平的检测7-11，基于蛋白质水平的检测方法有免疫学方法（ELISA、免疫印迹、免疫层析、蛋白质芯片等）、质谱检测方法和生物传感器检测方法，基于核酸水平的检测方法有聚合酶链式反应（PCR）、环介导等温扩增（LAMP）和基因芯片等。ELISA 检测方法相对较为成熟，已实现了商品化和标准化，常用于工业化生产中的大批量检测，在食品加工过程中过敏原结构易发生变化，加工食品基质也较为复杂，容易对抗原-抗体作用产生干扰，导致 ELISA 检测结果产生偏差。质谱检测和生物传感器检测方法对设备和操作技术要求较高，检测成本也较高。PCR 和 LAMP 技术克服了过敏原结构对检测结果的干扰
14、，但是在高通量上依然不占优势，多重PCR 引物之间易产生干扰，基因芯片技术可以实现大规模和高通量，但目前在过敏原检测中的应用还未见推广。近年发展起来的多重连接探针扩增（MLPA）技术，通过针对检测靶标设计特异性引物，用连接酶将与靶序列杂交的长探针和短探针连接成含通用引物的全长探针，每个探针扩增产物的长度唯一，产物可通过毛细管电泳分离，可以实现在单个反应中同时对50 个靶基因进行定性和半定量的分析，具有高灵敏度、高通量、操作简便、结果准确的优点，在遗传疾病、病原检测、肿瘤诊断等工作中得到了广泛的研究和应用12-21。本研究拟针对常见食品过敏原建立多重检测体系，开发其在食品过敏原检测中的应用潜力，
15、建立一种简便、快速、灵敏、准确、低成本的检测方法。1 材料与方法 1.1 材料与试剂 开心果、巴西坚果、芹菜、麸质（小麦、燕麦、大麦、黑麦）、夏威夷果、芝麻、榛子、大豆、花生、葵花籽、核桃、腰果、杏仁、芥末、大米、鱼、虾、蟹、牛奶、鸡蛋、桃及 20 份过敏原检测加工食品样本（婴幼儿辅食、固体饮料、糕点、方便食品、膨化食品、冷冻饮品）等均购于商超店。微生物材料（大肠埃希氏菌ATCC 25922、鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14028、金黄色葡萄球菌ATCC 6538）来自于本实验室储藏菌株。DNeasy meicon Food Kit购自德国Qiagen公司；SALSA MLPA EK5 reage
16、nt kit 100 reactions-FAM 购自荷兰 MRC-Holland 公司；MLPA 探针由武汉擎科生物公司合成；毛细管电泳缓冲液、POP-7 胶、Hi-Di Formamide、GeneScan 500 LIZ dye Size Standard 均购自美国 ABI 公司；Premix Ex Taq(Probe qPCR)购自大连宝生物公司。1.2 仪器与设备 5424R 高速冷冻离心机，德国 Eppendorf 公司；恒温金属浴，天根生化科技（北京）有限公司；T100 Thermal Cycler PCR仪和CFX96实时荧光定量PCR仪，美国Bio-rad 公司；3500 毛细管基因分析仪，美国ABI公司；Tissue LyserII 组织研磨仪和 QIAxpert 核酸浓度测定仪，德国 Qiagen 公司；A11 basic 研磨仪，德国IKA 公司；GM 300 均质器，德国 Retsch GmbH 公司。表 1 MLPA 检测探针及引物序列 Table 1 Probes and primers used in MLPA method ID Primer 名称